1 2 Başlamak için,transfeksiyondan 3 24 saat önce HEK 293T hücrelerine bakın 4 GMEN içeren 15 santimetrelik bir tabakta. 5 Hücreleri 37 santigrat derecede, 6 ve% 5 karbondioksitte,% 40 ila 50 birleşmeye ulaşana kadar inkübe edin. 8 Üç adet 15 mililitrelik plastik tüpü 9 uygun lentivirüs adıyla etiketleyin.
10 Her tüpe 1.710 mililitre indirgenmiş serum ortamı 11 ve 90 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin. 12 Tüpleri oda sıcaklığında inkübe etmeden önce içindekileri girdaplama 13 ile karıştırın. 14 Beş dakika sonra, ambalaj vektör karışımını 15 transfeksiyon ortamına ve girdaba ekleyin.
16 Daha sonra ilgili transfeksiyon karışımına 7,5 mikrogram yeniden programlama vektörü 17 ve pWPT-GFP kontrolü 18 ekleyin. 19 Tüpleri iki saniye 20 vorteksleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 21 293T hücrelerini her bir lentivirüs ile transfekte etmek için, 22 damla boyunca, tabağa bir transfeksiyon DNA karışımı ekleyin.
23 Kopyalanan hücreleri 37 santigrat derece 24 ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. 25 14 ila 16 saat sonra, 26 ortamı 30 mililitre 27 taze 293T ortam 28 ile değiştirin ve 60 ila 72 saat inkübasyona devam edin. 29 Hücreleri her gün 30 gözlemleyin ve transfeksiyon verimliliğini kontrol edin.
31 Daha sonra, virüs transfeksiyon kültürünü 32 15 mililitrelik tüplere 33 aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika 34 boyunca 1.932 G'de döndürün. 35 0,45 mikronluk bir şırınga filtresi 37 kullanarak lentiviral süpernatanı 36 50 mililitrelik yeni bir tüpe süzün. 38 Lentivirüs transdüksiyonundan bir gün önce, 39 kuyu başına 100.000 PDAC hücresi içeren 6 oyuklu bir plakanın 40 iki kuyusunu hazırlayın.
41 İki mililitre önceden ısıtılmış PDAC ortamı ile iki adet 15 mililitrelik tüp 42 hazırlayın. 43 İlk tüpe, 44 12 mililitre yeniden programlama lentivirüsü ekler. 45 Daha sonra 12 mikrolitre polibren 46 ekleyin ve pipetleyerek karıştırın.
47 İkinci tüpe, 48 iki mikrolitre polibren ekleyin. 49 Şimdi, ortamı 6 oyuklu bir plakanın 50 her bir oyuğundan 51 dikkatlice çıkarın ve oda sıcaklığında PBS ile bir kez yıkayın. 52 Yeniden programlama enfeksiyon ortamını 53 birinci tüpten ilk kuyucuğa ekleyin.
54 Karışımı ikinci tüpten ikinci kuyucuğa ekleyin. 55 Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede 56 %5 karbondioksit ve %5 oksijen ile inkübe edin. 57 Ertesi gün, her iki kuyucuğun ortamını 58 taze PDAC ortamı 59 ile değiştirin ve gösterildiği gibi 60 inkübasyona 48 saate kadar devam edin.
