Başlamak için, sol atriyum ve pulmoner venleri veya PV'leri farenin kalbinden izole edin. İzole edilen dokuyu kalp tabanı ve akciğer tepesi yukarı bakacak şekilde bir kriyokalıba yerleştirin. PV'lerin kıvrılmaları durumunda onları çözün ve çözün.
Ardından, kriyokalıbı OCT bileşiği ile doldurun. İnce forseps kullanarak, kalan havayı çıkarmak için PV'leri hareket ettirmeden hafifçe sıkıştırın. OCT bileşiğindeki dokuyu kuru buz üzerinde dondurun.
İmmün boyama için, donmuş fare PV slaytlarını bir boyama sistemi üzerinde 20 dakika boyunca çözdürün. Ardından, dokuyu slayta sabitlemek için bölümlere birkaç damla %4'lük bir paraformaldehit sabitleme solüsyonu uygulayın. İnkübasyondan sonra, slaytları dikey bir rafa taşıyın ve PBS ile dolu bir kaba daldırın.
Slaytları durulamak için kabı beş dakika boyunca yavaş bir çalkalayıcıya koyun. Ksilol içeren bir sıvı engelleyici kalem kullanarak, her slayttaki her bölümü daire içine alın. Ve boyama sistemindeki slaytları yeniden düzenleyin.
Bir Pasteur pipeti kullanarak, her numuneye bir veya iki damla geçirgenleştirme solüsyonu uygulayın. Ardından, slaytları PBS'de beş dakika yıkayarak Triton X-100 solüsyonunu temizleyin. Boyama sistemindeki slaytları yeniden düzenledikten sonra, her bölüme bir veya iki damla engelleme tamponu ekleyin ve tam kapsama alanı sağlayın.
Daha sonra, birincil antikorlar ve bloke edici tampondan oluşan birincil antikor karışımından bir mililitre hazırlayın. Slayttan kalan engelleme arabelleğini atın. Her bölüme iki veya üç damla primer antikor karışımı uygulayın.
İnkübasyondan sonra, slaytları dikey bir rafa yerleştirin ve hafif çalkalamayı sürdürürken slaytları beş dakika boyunca yıkama tamponunda durulayın. Daha sonra, ikincil antikorlar ve yıkama tamponundan oluşan ikincil antikor karışımından bir mililitre hazırlayın. Slaytları boyama sistemi üzerinde yeniden konumlandırın ve her bölüme iki veya üç damla ikincil antikor karışımı dağıtmak için bir pipet kullanın.
Ardından, sallarken slaytları her biri beş dakika boyunca üç kez yıkama tamponunda temizleyin. Daha sonra, boyama sisteminde düzenlenen her bölüme iki veya üç damla Hoechst 33342 çözeltisi ekleyin. Slaytları dikey bir rafa yerleştirin ve hafif çalkalama ile yıkama tamponunda beş dakika durulayın.
Her slayta bir veya iki damla floresan montaj ortamı ekleyin ve slaytları kapak kızaklarıyla kapatın. Sol atriyumdaki pulmoner ven orifisi bölgesi ve pulmoner ven bileşkesi, ekstrapulmoner venler ve interpulmoner venler 10X büyütme altında izlendi. Pulmoner ven deliğinde, ekstrapulmoner venlerde ve intrapulmoner venlerde tipik bir kas çizgisine sahip spesifik cTnT sinyalleri 40X büyütmede gözlendi.
Cx43 her üç pulmoner bölgede de bulundu ve öncelikle komşu kardiyomiyositler arasında yansıtıldı. Miyokard manşonlarındaki kardiyomiyositlerin polar tarafında ve lateral tarafında Cx43 ile ilişkili sinyaller gözlendi.
