Drug Screening Using Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Cell Lysate Preparation for mRNA Sequencing

Başlamak için, PBMC'nin kriyo şişesini 37 santigrat derecede bir su banyosunda iki ila üç dakika boyunca hafifçe ters çevirerek çözdürün. Daha sonra çözülmüş hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Kriyo şişesini bir mililitre ılık tam büyüme ortamı ile durulayın ve ilk seyreltme adımını gerçekleştirmek için çözeltiyi konik tüpteki hücrelere damla damla ekleyin.

Şimdi hücre süspansiyonunu beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarmak için konik tüpü akıcı bir şekilde eğin. Hücreleri üç mililitre sıcak tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Hücre sayımı için 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu tripan mavisi ile karıştırın.

Hücreleri, otomatik bir hücre sayacı veya bir hücre odası ile 10 mikrolitre lekeli hücre çözeltisi kullanarak sayın. Mililitre başına bir kez 10 ila altıncı hücrenin nihai konsantrasyonunu elde etmek için hücreleri seyreltmek için ılık tam büyüme ortamı kullanın. Daha sonra, 96 oyuklu bir hücre kültürü plakasının her bir oyuğuna 100 mikrolitre hücre süspansiyonu tohumlayın.

Her kuyucuğa iki kez ilaç seyreltmesinden 100 mikrolitre ekleyin. Hücreleri hasat etmek için hücre kültürü plakasını 10 dakika santrifüjleyin. Hücreleri tutmak için pompa ucunu kuyunun alt köşesine yerleştirirken süpernatanı çıkarmak için bir vakum pompası kullanın.

Şimdi her kuyucuğa 200 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ekleyin. Plakayı beş dakika santrifüjledikten sonra, süpernatanı çıkarın. Daha sonra her bir kuyucuğa 15 mikrolitre lizis tamponu ekleyin.

Yapışkan sızdırmazlık filmi kullanarak, kirlenmeye karşı korumak için plakayı kapatın. Plakayı vorteksleyin ve bir dakika santrifüjleyin. Son olarak, bir PCR plakasında altı mikrolitre parçalanmış hücre çözeltisi toplayın.