Başlamak için, 25 milimetre cam kapak kisimlerini altı oyuklu bir hücre kültürü plakasının kuyularına yerleştirin. Her kapak fişinin ortasına bir damla polilisin koyun. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, her bir kapak fişini damıtılmış suyla üç kez yıkayın.
Daha sonra kapak fişlerini iki kez kalsiyum içermeyen bir tuzlu su çözeltisiyle yıkayın. Ardından, kapakları bir kayıt odasına takın ve kalsiyumsuz salinle doldurun. Drosophila'nın istenen genetik çaprazlamasından dolaşan üçüncü instar larvalarını toplayın.
Larvaları bir tabağa iyice aktarın, ardından larvaları üç kez damıtılmış suyla yıkayın. Larvaları 750 mikrolitre buz gibi, kalsiyumsuz tuzlu su çözeltisi içeren başka bir cam diseksiyon kabına yerleştirin. Şimdi stereo mikroskop altında bir larva yerleştirin.
Bir çift forseps ile karnın arkasından enine bir kesim yapın. Larvaları ters çevirmek için çeneyi forseps ile itin. Çenenin yanındaki ventral sinir kordonunu gözlemleyin.
Hayali diskleri ve kalan beyin kundağı dokularını dikkatlice çıkarın. Daha sonra, ventral sinir kordonunu merkezi beyin ve optik loblarla dokunun geri kalanından ayırın. Ventral sinir kordonunu kalsiyumsuz salin solüsyonu içeren kayıt odasına aktarın.
Paraziti önlemek için, kalan sinirleri forseps ile kapak kaymasının altına tutturun. Yağ gövdeleri üzerinde deneyler yapmak için, yağ dokularını ortaya çıkan larvadan izole etmeye devam edin. Perde sensörlerini ifade eden izole yağ gövdelerini kayıt odasına yerleştirin.
Sensörleri ifade eden dokuların görüntülerini elde etmek için mikroskobun aydınlatma sistemini açın. Ventral sinir kordonlarını veya yağ cisimciklerini içeren kayıt odasını bir floresan mikroskobu üzerine yerleştirin. GCaMP6f floresansını görüntülemek için, uyarma dalga boyunu 488 nanometre olarak ayarlayın.
Laconic, pyronic, ATP veya glukoz sensörleri gibi metabolitler için uyarımı 440 nanometreye ayarlayın. Şimdi GCaMP6f ve metabolit sensörü için görüntü alımını düzenli aralıklarla ayarlayın. Suya daldırma objektifini su altında kalmasını sağlayacak şekilde yerleştirin.
Ardından, kayıt odasını bir perfüzyon sistemine bağlayın. Sıvıyı hazneden çıkarmak ve dakikada üç mililitrelik sabit bir akış sağlamak için düşük akılı bir peristaltik pompa kullanın. Tüpleri içeren çözeltiyi mikroskop tablasının 25 santimetre yukarısına yerleştirin.
Herhangi bir stimülasyondan önce, kayıt çözeltisinin beş ila 10 dakika boyunca akmasına izin vererek stabil bir floresan taban çizgisi elde edin. Şimdi, akış solüsyonunu beş dakika boyunca glikoz, piruvat veya laktat içeren stimülasyon solüsyonu ile değiştirin. Nöronal aktiviteyi değerlendirmek için 80 mikromolar pikrotoksine maruz bırakılan uyarılmış ventral sinir kordonunun görüntülerini yakalayın.
Hem glial hücrelerdeki hem de motor nöronlardaki özlü sensörler, nabzın başlangıcında bir milimolar laktata benzer oranda yanıt verir. Bununla birlikte, motor nöronlar, beş dakikalık nabız sırasında taban çizgisine göre daha yüksek bir artışa ulaşır. Glikoz sensörünün sinyali, beş milimolar glikoza maruz kaldığında glial hücrelerde ve nöronlarda benzer bir oranda artmıştır.
Bununla birlikte, glikoz nabzı sırasında, nöronlardaki sinyal, glial hücrelerden daha fazla artar. Chaski taşıyıcısını devre dışı bırakmak, glial hücrelerde laktat taşınmasını azalttı. Nöronal aktivitede pikrotoksin kaynaklı artışlar, motor nöronların somasında ATP seviyelerinde geçici bir düşüşe neden oldu.
Laconic sensörün şişman cisimlerde iyi ifade edildiği gözlendi. Yağ kütleleri artan glikoz konsantrasyonuna maruz kaldığında glikoz sensörlerinin artan floresansı görülmüştür. Artan laktat ve piruvat konsantrasyonları, özlü ve pironik floresanda orantılı bir artışa neden oldu.
