Başlamak için, PFF enjekte edilmiş C57 siyah altı farenin parafin beyin bölümlerini alın. Slaytları ksilen ikamesine batırarak ve iki dakika inkübe ederek mumdan arındırın. Rehidrasyon için slaytları %100 %95 ve %70 etanole ve ardından iki kez deiyonize suya batırın.
Numuneleri çift damıtılmış su ile birlikte mikrodalgaya uygun bir kaba aktarın. 100 kez sitrat tamponunu pH altı ile dört santigrat derecede ısıtın. Ardından 350 mililitre taze sitrat tamponu hazırlayın.
Hazırlanan sitrat tamponunu kapaklı plastik bir kaba dökün. Slaytları sitrat tampon kabına yerleştirin ve kapağı sabitleyin. Numuneleri dört dakika boyunca 700 watt'ta mikrodalgada ısıtın ve ardından beş dakikalık bir dinlenme için zaman tanıyın.
1,5 dakika daha mikrodalgada pişirin, ardından beş dakikalık bir dinlenme süresi izleyin ve sitrat tamponunu doldurun. 1,5 dakika mikrodalgada pişirin ve beş dakika dinlendirin. Daha sonra numuneleri ve sitrat tamponunu buz üzerinde 20 dakika soğutun ve çift damıtılmış suyla yıkayın.
Numune slaytlarını dokuya dokunmadan bir kağıt havlu kullanarak kurutun. Bir pap kalem kullanarak, doku parçalarının etrafına dikdörtgenler çizin. Şimdi tüm slaytları bir slayt bağışıklık boyama kutusuna aktarın.
TBS-T damlalarının PAP kalem dikdörtgenleri içinde kalmasını sağlamak için TBS-T ile birden çok kez nazikçe yıkayın. TBS-T'yi çıkarmak için slaytları bir kağıt havluya hafifçe vurun. Her dikdörtgene 50 mikrolitre bloke ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.
İnkübasyonun sonunda, bir kağıt havlu kullanarak, bloke edici çözeltiyi numunelerden çıkarın. Her dikdörtgene 50 mikrolitre birincil antikor karışımını ve TBS-T'yi nazikçe pipetleyin ve numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ardından slaytları TBS-T ile yıkayın.
Bir kağıt havluya dokunarak TBS-T'yi çıkarın. Bu işlemi üç kez tekrarlayın. Daha sonra, her dikdörtgene TBS-T'de bir ila 1000 seyreltmede 50 mikrolitre ikincil antikor karışımı ekleyin ve karanlıkta bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra, numuneyi TBS-T ile üç kez yıkayın. Daha sonra numuneyi bir dakika boyunca TBS-T'de mililitre başına iki mikrogram konsantrasyonda DAPI ile inkübe edin. DAPI solüsyonunu bir kağıt havluya vurarak çıkarın ve TBS-T ile üç kez yıkayın.
Bir cam kapak fişi monte etmek için, numunelere montaj reaktifi slaytı başına iki damla ekleyin. Kabarcıkları gidermek için kapak kızağına hafifçe bastırın ve numuneleri oda sıcaklığında bir saat kurumaya bırakın. 50 kat yağ objektifi veya konfokal teknoloji ile donatılmış yapılandırılmış bir aydınlatma floresan görüntüleme sistemi kullanarak çeşitli alanlarda en az 60 hücreyi görüntüleyin.
Hücreleri analiz etmek için, pozitif veya negatif hücrenin etrafına bir kontur çizerek ve kırpma işlevini kullanarak ilgilenilen bölgeyi izole edin. Ardından, şekil tanımlayıcılarını etkinleştirin ve ayarlanan ölçüm fonksiyonunda eşik seçeneklerini sınırlayın. Ayar menüsünde eşik işlevini seçerek eşik seviyesini ayarlayın.
Son olarak, parçacıkları analiz etme aracını kullanın ve mitokondriyi yakalamak için uygun bir boyut ayarlayın. Örneğin, boyutu 25 sonsuz olarak ayarlayın, ardından piksel birimlerini etkinleştirin ve maskeleri göster'i seçin"Tirozin hidroksilaz VDAC1, PS129 alfa-sinüklein ve DAPI için boyanmış PFF enjekte edilmiş farelerin önemli nigra pars compacta ko-aminosu gösterilir. Anti PS129 alfa-sinüklein boyama, PS129 lezyonlarını barındıran hücreleri sağlıklı hücrelerden ayırt etmeye izin verdi.
Tirozin hidroksilaz pozitif nöronların VDAC1 boyamasının görüntü analizi, PS129 lezyonları taşıyan nöronlar ile bunlardan yoksun nöronlar arasında hem mitokondriyal sayı sayılarında hem de en boy oranında bir azalma olduğunu ortaya koydu.
