Başlamak için, HeLa hücrelerine% 0.25 Tripsin-EDTA Çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede iki ila üç dakika inkübe edin. Hücreleri pipetleyerek nazikçe ayırın ve hücre geçişi için bir ila dört oranında yeni plakalara tohumlayın. Plazmidi HeLa hücrelerine transfekte etmek için, bir mikrogram doğrulanmış PX458 sgRNA plazmidini, tüp A.In tüp B'de 50 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı ile karıştırın, iki mikrolitre transfeksiyon reaktifi ve 50 mikrolitre indirgenmiş serum ortamını nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.
Ardından, A ve B tüplerinin içeriğini birleştirin ve oda sıcaklığında beş dakika daha inkübe edin. Karışımı 12 oyuklu plakaya ekleyin ve hücreleri altı saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, ortamı taze DMEM ortamı ile değiştirin.
24 veya 48 saat sonra, HeLa hücrelerini bir floresan mikroskobu altında inceleyerek transfeksiyon verimliliğini değerlendirin. Transfekte edilen HeLa hücrelerini% 0.25 tripsin EDTA kullanarak tamamen ayırın ve 37 santigrat derecede üç ila beş dakika inkübe edin. Ardından, bir Neubauer odası veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
Hücreleri, seri seyreltme yöntemlerini takiben transfekte edilen her popülasyon için üç ayrı 96 oyuklu plakaya yerleştirin. Hücreleri bir ila iki hafta boyunca nemlendirilmiş bir inkübatöre geri koyun. CENP-E Knockout'un fenotipe dayalı taraması ve doğrulanması için, hücreleri beş ila yedi gün boyunca 24 oyuklu veya 12 oyuklu plakalarda ayırın ve genişletin.
10 kat ve 20 kat büyütme objektif lensleri ile ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak daha küçük koloni çaplarına sahip mutant hücreleri tarayın. Ardından, üreticinin talimatlarını izleyerek Kolon Hayvan Genomik DNA Ekstraksiyon Kitini kullanarak DNA ekstraksiyonu için hücreleri toplayın ve polimeraz zincir reaksiyonlarını ayarlayın. Hedef DNA'yı, üreticinin protokolleri tarafından yönlendirildiği şekilde pMD18-T Vektörüne bağlayın.
Bağlanmış plazmiti yetkin DH5-Alfa hücrelerine aktarın ve klon seçimi için kültüre devam edin. CENP-E Nakavt türlerini belirlemek için, üreticinin yönergelerini izleyerek bir Plazmid Ekstraksiyon Kiti yardımıyla plazmit DNA'yı izole edin. Daha sonra, M13 ileri ve geri primerleri kullanarak her koloninin plazmit DNA'sı için Sanger dizilimi gerçekleştirin.
Yabani tip ve CENP-E mutant HeLa hücrelerini 24 oyuklu bir plakada 12 milimetrelik cam kapak kızaklarına tohumlayın. DMEM ortamının tamamını çıkarın ve hücreleri% 4 paraformaldehit ve PBS çözeltisi kullanarak oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin. Daha sonra, çekirdekleri DAPI ile oda sıcaklığında beş dakika boyayın.
Bir floresan mikroskobu kullanarak kromozom hizalama fenotipine dayalı olarak CENP-E mutant hücrelerini gözlemleyin ve doğrulayın. Kolonilerin fenotipik taraması, CENP-E Nakavt hücrelerinin, kontrol grubuna kıyasla artmış kromozom yanlış hizalaması gösterdiğini gösterdi.
