CRISPR/Cas9 Aracılı CENP-E Nakavt HeLa Hücrelerinin Kromozom Hazırlanması ve Karyotip Analizi

Başlamak için, vahşi tip ve CENP-E mutant HeLa hücre kültürlerini alın ve beş saat boyunca inkübe etmeden önce 300 nanomolar kolşisin ekleyin. Daha sonra, hücreleri% 0.25 tripsin-EDTA ile 37 santigrat derecede üç dakika inkübe edin ve hücreleri 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine toplayın. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1000 G'de santrifüjleyin, süpernatantları atın ve 1.2 mililitre 0.075 molar potasyum klorür çözeltisi ekleyin.

Hücreleri 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleyin, süpernatanı atın ve önek için 0.2 mililitre fiksatif çözelti ekleyin. Bir dakika boyunca hafifçe karıştırın, daha sonra daha önce gösterildiği gibi hücre peletlerini toplayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.5 mililitre fiksatif çözelti ekleyin.

Hücreleri santrifüjledikten ve süpernatanı attıktan sonra, bir hücre süspansiyonu oluşturmak için 0.6 mililitre fiksatif çözelti ekleyin. Buz kızaklarının üzerine 35 ila 40 santimetre arasında üç ila beş damlacık damlatın. Slaytları hemen bir alkol lambası kullanarak kurutun ve yedi dakika boyunca %10 Giemsa'nın kalıcı solüsyonu ile boyayın.

Slaytları iki dakika boyunca akan su ile durulayın, ardından numuneleri Plan Fluor 40 kat büyütme 0,75 sayısal diyafram objektifi ile donatılmış bir ışık mikroskobu kullanarak inceleyin. Karyotip analizi, CENP-E mutant HeLa hücrelerinde vahşi tip hücrelere kıyasla kromozom sayılarında azalma olduğunu ortaya koydu.