Başlamak için, çizgi Agrobacterium tumefaciens hücre kültürünü seçici antibiyotik takviyeli Maya Mannitol Agar plakalarına dönüştürür. Plakaları gece boyunca 28 santigrat derecede ayakta duran bir inkübatörde inkübe edin. Ertesi gün, kültürden kolonileri 12.5 mililitre Maya Mannitol Luria-Bertani et suyu karışımı üzerine aşılayın ve 250 RPM'de 16 saat boyunca 28 santigrat derecede bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
112.5 mililitre Maya Mannitol suyuna LBA4404 12.5 mililitre Agrobacterium suşu antibiyotiklerle aşılayın. Kültürü 250 RPM'de 16 saat boyunca 28 santigrat derecede bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Kültür suyu ile gece kültürünü 0.4'lük bir optik yoğunluğa ayarlayın.
Daha sonra inkübasyondan önce 20 mikromolar asetosiringon ekleyin. İnkübe edilmiş kültür, bir optik yoğunluğa ulaştığında, hücreleri peletlemek için santrifüjleyin. Peletin süspansiyon çözeltisi içinde 0.6'lık bir optik yoğunluğa yeniden süspanse edilmesi ve inkübasyondan önce 200 mikromolar asetosiringon eklenmesi.
Agroinfiltrasyon için, yapraklı dalları olan odunsu kakao bitkilerini seçin. Agrobacterium süspansiyonuna 250 mikromolar jasmonik asit ekleyin. Ardından, içerideki basıncı ölçmek için vakum haznesi olarak vakum göstergeli bir desikatör kurun.
Bitki dalının geçmesine izin vermek için bir atlama halkası yerleştirin. Agrobacterium kültürüne sahip beheri desikatörün içine yerleştirin ve dalı, istenen yapraklar Agrobacterium kültürüne batırılmış olarak desikatör ile kapağı arasına yerleştirin. Ardından, atlama halkası, bitki dalı ve desikatör arasındaki boşlukları kapatmak için silikon baskı malzemesi kullanın.
Silikon malzeme polimerize olduktan sonra, desikatörü boşluk bırakmayacak şekilde kapatın ve ardından vakum pompasına bağlayın. Vakum pompasını eksi 0,07 megapaskal'a ulaşana kadar çalıştırın. İstenilen basınca ulaşıldığında, basınç valfini kapatın ve basıncı beş dakika korumak için pompayı kapatın.
Hazne basıncını eski haline getirmek için basınç valfini kademeli ve sabit bir şekilde açın. İnfiltrasyonu iki kez daha tekrarladıktan sonra, dalı hücre süspansiyonundan çıkarın. Sızan yaprakları damıtılmış suyla temizleyin, ardından bitkileri 48 saat boyunca karanlıkta 25 santigrat dereceye koyun.
İnkübasyondan sonra, sızan dokuyu 16 saatlik aydınlık ve sekiz saatlik karanlık fotoğraf periyoduna maruz bırakın. Bitkilerin sızan yaprakları, Agrobacterium penetrasyonunun göstergesi olan bazı kısımlarda daha koyu görünür. Kullanılan raportör sistemi, yapraklarda çıplak gözle parlak kırmızı pigmentasyon olarak kolayca gözlemlenebilen betalain birikimi üretti.
Betalain birikiminin doku canlılığına göre değiştiği gözlendi.
