SHSY 5Y hücrelerini, mililitrede dört hücreye güç verecek şekilde 15 x 10 ışın yoğunluğunda cam alt hücre kaplarına kaplayarak başlayın. Hücreleri% 1 FBS içeren kültür ortamında beş gün boyunca all-trans retinoik asit ile tedavi edin, ardından iki gün boyunca beyin kaynaklı nörotrofik faktör ile tedavi edin. Daha sonra hücreleri steril PBS ile yıkayın.
Hücreleri% 1 FBS ile birlikte eşit miktarda MEM ve F12 ortamı kullanarak 10 ila 7 molar RA veya izoform agonistleri ile 72 saat boyunca tedavi edin. Ortamı, 45 dakika boyunca 20 nano molar TMRM ile karıştırılmış taze% 1 FBS içeren kültür ortamı ile değiştirin. Hücreleri, 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir lazer taramalı konfokal mikroskoba bağlı bir inkübatöre yerleştirin.
Görüntüleri 63x yağa daldırma apokromatik objektif kullanarak yakalayın. Görüntü boyutunu, bir alan birimi iğne deliği açıklığıyla 512 x 512 piksel olarak ayarlayın. Her hücre plakasındaki beş farklı görsel alandan 15 karelik bir zaman serisi ve sekiz eşit uzaklıktaki Z düzleminden oluşan bir Z yığını toplayın.
Elde edilen LSM dosyası zaman, konum ve Z yığını verilerini içermelidir.