Başlamak için, eşit miktarda bazal membran ekstraktı veya BME'de hasta kaynaklı organoidler veya PDO süspansiyonu içeren bir tüp alın. 20 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, önceden ısıtılmış 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunun ortasına beş mikrolitrelik kubbe yerleştirin. Tüm kuyucukları ektikten sonra, kapağı tabağa yerleştirin ve yavaşça ters çevirin.
Kubbelerin katılaşmasını sağlamak için ters çevrilmiş plakayı doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Plakayı, kapak yukarı bakacak şekilde ters çevirin. Sonra tekrar inkübe edin.
PDO'ları içeren plakalara floresan boyalar ve ilaçlar ekledikten sonra. Plakayı beşinci alıntıya yerleştirin. Gen5 yazılımını başlatın ve görev yöneticisi penceresinde görüntüleyici manuel modunu seçin ve şimdi yakala'ya tıklayın.
Ayarlarda hedefi, filtreyi, mikroplaka formatını ve kap tipini belirtin, kapak kullan ve daha yavaş taşıyıcı hızı kullan'ı seçin ve Tamam'a tıklayın. Sonra ilgilendiğiniz bir kuyu seçin. Parlak alan kanalını seçin, otomatik pozlamaya tıklayın ve ayarları gerektiği gibi yapın.
Z yığınını ayarlamak için görüntüleme modu sekmesini genişletin, Z yığını'nı seçin ve tüm PDO'lar odak dışına çıkana kadar kurs ayarlama oklarını kullanarak odağı ayarlayın. Bu noktayı Z yığınının alt kısmı olarak belirleyin ve üst kısmı ayarlamak için tersten tekrarlayın. Ardından, görüntüleme düzenleme adımını açarak floresan kanallarını ayarlayın.
Kanallar altında, istediğiniz kanal sayısını seçin, parlak alan için bir kanal ve her floresan kanal için ek kanallar belirleyin. Tamam'a tıklayarak pencereyi kapatın, ilk floresan kanalın pozlamasını ayarlamak için açılır menüyü GFP olarak değiştirin, otomatik pozlama'ya tıklayın ve arka plan sinyalini azaltmak için pozlama sekmesi altındaki pozlama ayarlarını yapın. Pozlama ayarlarını görüntü modu sekmesine kopyalamak için, kopyala simgesini tıklatın ve ardından yeni bir pencere açmak için görüntüleme adımını düzenle'yi tıklatın.
GFP kanalında, kanala aydınlatma, entegrasyon süresi ve kamera kazancı ayarları eklemek için pozlama çizgisindeki pano simgesine tıklayın. Şimdi kamera simgesine tıklayın ve işleme adımı ekle altında görüntü ön işlemeyi seçin. Parlak alan sekmesinde, görüntü ön işlemeyi uygula seçeneğinin işaretini kaldırın.
Her floresan kanal sekmesi için, görüntü ön işlemeyi uygula seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun. Seçimi kaldırın, birinci kanalla aynı seçenekleri kullanın ve ardından pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklayın. Şimdi işleme ekleme adımının altındaki Z projeksiyonuna tıklayın, gerekirse dilim aralığını ayarlayın ve Tamam'a tıklayarak pencereyi kapatın.
Kinetik görüntüleme protokolünü ayarlamak için araç çubuğunda görüntü kümesi'ne tıklayın ve açılır menüden Bu görüntü kümesinden deneme oluştur'u seçin. Diğer başlığın altındaki seçeneklere tıklayın ve süreksiz kinetik prosedür kutusunu işaretleyin. Tahmini toplam süre altında, denemenin çalışma zamanını girin.
Tamam'ı tıklatarak pencereyi kapatın. Ek olarak, şu anda plaka düzenini ve sıcaklık gradyanını ayarlayın. Pencereleri tıklatarak veri azaltma adımlarını doğrulayın.
Ardından dosyaya gidin ve araç çubuğunda protokolü farklı kaydet'i tıklayın. Bir kaydetme konumu seçin. Bir dosya adı girin ve kaydet'i tıklayın.
Kinetik görüntülemeye başlamak için, protokolü bio spa on demand planlama yazılımına yükleyin ve uygun bir yuva seçin. Prosedür bilgisi sekmesinde, menüden kullanıcıyı seçin. Protokol yuvasının yanında, seç'e tıklayın ve yeni bir giriş ekle'yi seçin.
Şimdi protokol yuvasının yanındaki seç'e tıklayın. Gezinmek ve protokolü zamanlama yazılımına aktarmak için aç'a tıklayın. Plaka için gerekli görüntüleme süresini girin ve pencereyi kapatmak için Tamam'a tıklayın.
Aralık altında, istenen görüntüleme sıklığını girin, plaka doğrulama sırasını başlatmak için programı, plakayı veya kabı seçin, bu programı kabul etmek için evet'e tıklayın.
