İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin hepatik farklılaşmasını başlattıktan 27 gün sonra, hücreleri kuyu başına iki mililitre PBS ile yıkayın. Verilen bileşenleri kullanarak enzim çözeltisini ADS tamponunda hazırlayın. Altı oyuklu bir plakanın oyuğu başına bir mililitre çözelti ekleyin.
Hücreleri plakadan ayırmak için plakayı 37 santigrat derecede yaklaşık iki saat boyunca dönen bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Hücre ayrılmasını bir mikroskop altında onaylayın, daha sonra hücre süspansiyonunu tek hücrelere dağıtmak için pipetleyin ve bunları hepatosit olgunlaşma ortamını içeren 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. Hücre süspansiyonunu 200G'de 18 santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin.
Ve bir aspiratör kullanarak süpernatanı çıkarın. Hücrelerin mitokondrisini boyamak için, peleti 100 nanomolar TMRM içeren beş mililitre hepatosit olgunlaşma ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri ışıktan korurken 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Yine, hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve peleti% 2 FBS içeren bir ila beş mililitre soğuk ADS tamponunda yeniden süspanse edin. Hücre sayımından sonra, 500.000 hücreyi 1.5 mililitrelik bir tüpe alikot edin ve bunu birincil antikor kontrolü yok olarak etiketleyin. Kalan hücre süspansiyonunu 200G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
Bir milyon hücre başına 100 mikrolitre seyreltilmiş primer antikor ekleyin. Hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 50 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve hücreleri% 2 FBS içeren soğuk ADS tamponu ile iki kez yıkayın.
Şimdi bir milyon hücre başına 100 mikrolitre seyreltilmiş ikincil antikoru, birincil antikora, lekeli veya lekesiz hücrelere ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Yine, hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve hücreleri% 2 FBS içeren soğuk ADS tamponu ile iki kez yıkayın. Hücreleri ADS tamponunda yeniden süspanse ettikten sonra, bunları bir geçmeli kapaklı hücre süzgecinden süzün ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.
