Liyofilize MOG 35 55 peptidini suda tekrar süspanse ederek başlayın. Deneyden önce peptit stoğunu kaplama tamponunda mililitre başına 10 mikrograma kadar seyreltin. Şimdi 100 mikrolitre nihai çözeltiyi 96 oyuklu bir plakanın kuyularına pipetleyin.
Aynı anda eşit sayıda kuyucuğu kaplama tamponunda çözülmüş 100 mikrolitre BSA ile kaplayın. Buharlaşmayı önlemek için plakayı yapışkan bir filmle kapatın ve plakayı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, 20 arasında% 0,5 ile desteklenmiş 200 mikrolitre PBS ile plakayı üç kez yıkayın.
Daha sonra, PBS'de% 3 BSA'dan oluşan bir blokaj çözeltisinin kuyu başına 100 mikrolitre ekleyin. Kapalı plakayı bir hibridizasyon fırınında 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, plakayı PBST oyuğu başına 200 mikrolitre ile üç kez yıkayın.
EAE ile aşılanmış farelerin kanından elde edilen her serum örneğini bloke edici solüsyon içinde seyreltin ve hem MOG 35 55 hem de BSA kaplı oyuklara oyuk başına 100 mikrolitre ekleyin. Belirlenen boş kuyucuklara aynı hacimde engelleme çözeltisi ekleyin. Mühürlü plakayı sürekli çalkalayarak oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve plakayı PBST oyuğu başına 200 mikrolitre ile üç kez durulayın. HRP konjuge ikincil antikoru, PBST'de% 0.2 BSA'dan oluşan bir çözelti içinde seyreltin ve her oyuğa 100 mikrolitre ekleyin. Mühürlü plakayı oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin ve sürekli çalkalayın.
Plakayı PBST kuyusu başına 200 mikrolitre ile üç kez yıkayın. Her oyuğa 100 mikrolitre üç, üç asal, beş, beş asal tetrametil benzidin substratı ekleyin. Karanlıkta bir ila beş dakika inkübe edin, mavi bir rengin gelişimini izleyin.
Her kuyucuğa 100 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin. Ardından, her bir oyuktaki optik yoğunluğu ölçmek için 450 nanometre dalga boyunda ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanın. EAE numunelerinin optik yoğunluk değerleri, kontrol numunelerinden önemli ölçüde daha yüksekti ve bu da MOG peptidine karşı sağlam bir immünoglobulin G tepkisi olduğunu gösteriyordu.
