Başlamak için, Brassica napus DH12075 tohumlarını mikro tüplere yerleştirin. Tohumları yağdan arındırmak için mikro tüpe su ve% 0.1 deterjan ekleyin ve 60 saniye çalkalayın. Şimdi tohumları suyla ve ardından her biri 60 saniye boyunca% 70 etanol ile durulayın.
Daha sonra tohumları% 10 sodyum hipoklorit çözeltisine koyun ve 20 dakika çalkalayın. Ağartıcıyı çıkardıktan sonra, tohumları her biri 60 saniye boyunca dört kez steril suyla yıkayın. Tohumları, tohum çimlenme ortamını içeren bir Petri kabına yerleştirin.
Çanağı bir yetiştirme odasına taşımadan önce tohumları gece boyunca dört santigrat derecede soğuk tabakalandırın. Beş gün sonra, fideleri bir bitki yetiştirme ortamı içeren bir bitki kültürü kutusuna aktarın. Tüylü bir kök indükleyici plazmid taşıyan PRIA 4B'yi beş mililitre LB ortamında Ti less agrobacterium tumefaciens C58C1'i aşılayın.
Kültürü, 600 nanometrede 0.9'a bir optik yoğunluğa ulaşana kadar gece boyunca 28 santigrat derecede büyütün. Bakteri aşısını şırıngaya aktarın. Şırıngaya monte edilmiş 26 gauge bir iğne kullanarak, 18 günlük bir fidenin hipokotilini büyüme ortamının yaklaşık bir santimetre yukarısında delin.
Yaraya yaklaşık 50 mikrolitre inokülum enjekte edin ve hipokotil yüzeyindeki dokuyu çizin. Bitkiyi iki ila dört hafta boyunca 21 santigrat derecede yetiştirme odasına geri koyun. Daha sonra, hipokotilden çıkan tüylü köklerle nasırı kesin.
Kıllı kökleri olan nasırı, kıllı kök büyüme ortamı ve agrobakteriyel büyümeyi baskılamak için antibiyotikler içeren bir Petri kabına yerleştirin. Çanağı 24 santigrat derecede inkübe etmeden önce gaz geçirgen bantla kapatın. Kuluçkadan sonra, tüylü kökleri nasırdan izole edin ve tek tek kökleri tüylü kök büyüme ortamına aktarın.
Alternatif olarak, yabani tip sürgünler ve transgenik tüylü köklerden oluşan kompozit bir bitki oluşturmak için bitkinin doğal köklerini çıkarın. Daha sonra ortaya çıkan tüylü kökleri olan bitkiyi, agrobakteriyel büyümeyi baskılamak için bitki büyüme ortamı ve antibiyotikler içeren bir kültür kutusuna aktarın.
