Başlamak için, göz kabını hazırlamak için USDA tarafından denetlenen bir kasap dükkanından elde edilen enükleasyonlu gözleri sterilize edin ve inceleyin. Göz kabını, içi yukarı bakacak şekilde, hücre süzgecini içeren Petri kabına nazikçe yerleştirin. Soğutulmuş DPBS'yi göz kabına ekleyin ve sıvı seviyesinin insizyonun en alt noktasının hemen altında olduğundan emin olun.
Bir el feneri altında, nöral retinanın retina pigment epitelinden ayrılmaya başladığı alanları bulun, ardından kaldırılan nöral retinayı nazikçe tutmak ve soymak için künt cımbız kullanın. Nöral retinayı optik diskin yakınında nazikçe toplayın. Vakum aspirasyon sistemine bağlı bir mera pipeti kullanarak nöral retinayı aspire edin.
Aspire edilen hacmi değiştirmek için dikkatlice ek soğutulmuş DPBS ekleyin. Şimdi, kalan nöral retinayı çıkarmak için bu eklenen DPBS'yi aspire edin. Nöral retinayı tüm göz kapaklarından çıkardıktan sonra, her bir göz kabına nazikçe tripsin ekleyin ve Petri kabı kapağını değiştirin.
Gözleri tripsin ile 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile 30 dakika inkübe edin. Bir el feneri altında, retina pigment epitel hücrelerini her bir göz kabından nazikçe çıkarmak için bin mikrolitrelik pipet kullanın. Yerinden çıkan hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.
Kalan hücreleri toplamak ve tripsini nötralize etmek için göz kapağını hücre kültürü ortamıyla yıkayın. Bu ortam içeren hücreleri önceden toplanmış hücrelerle karıştırın. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250G'de santrifüjleyin.
Sonra, hücre peletini bozmadan süpernatanı çıkarın. Her hücre peletini üç mililitre D anase çalışma solüsyonunda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile 15 dakika inkübe edin.
Ardından, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 150G'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini üç mililitre taze hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. İki ila üç gözden elde edilen hücreleri altı oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın ve bunu geçiş sıfırı olarak kabul edin.
Ardından, tohumlanmış altı oyuklu plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir inkübatöre dikkatlice aktarın. Primer retinal pigment epitel hücreleri, izolasyondan üç gün sonra karakteristik pigmentasyon belirgin olarak domuz gözlerinden izole edildi. Hücreler, sağlıklı bir tek tabakanın göstergesi olan bir hafta sonra tam birleşme elde etti.
Anormal morfoloji ve aşırı pigmentasyon sergileyen kültürler kontamine olarak kabul edildi ve deneylerde kullanılmadı.
