Başlamak için, floroforla konjuge EV-mikroRNA ve hücre-mikroRNA ile transfekte edilmiş Calu6 hücrelerini alın. Hücre süspansiyonunu, yuvarlak tabanlı polistiren FACS tüpleriyle birlikte verilen 35 mikrometrelik bir süzgeç kapağından süzün. Ardından akış sitometrisi cihazını kurun, akış sitometresini açın ve kullanmadan önce 30 dakika ısınmasına izin verin.
Akışkan sistemi kılıf sıvısı ile doldurun. Bundan sonra, lazer hizalamasını doğrulayın ve ayarlayın. Kalite kontrol için, ultra saf filtrelenmiş suyu akış sitometresine yükleyin ve uygun bir akış hızında çalıştırarak yeterli bir alım süresi sağlayın.
Ardından, FSC 5.000'de Calu6 hücrelerinden sinyal yakalama eşiğini ayarlayın. Floroforlar arasındaki spektral örtüşmeyi hesaba katmak için, transfekte edilmemiş hücreler ve sadece bir florofor ile transfekte edilmiş hücreler kullanarak kompanzasyon kontrolleri hazırlayın. Sırasıyla 258, 192, 269 ve 423 voltaj birimlerinde ayarlanan FSC, SSC, FITC ve PE kanallarını kullanarak transfekte edilmiş hücrelerde ekspresyon analizi gerçekleştirin.
Ardından negatif kontrol örneğini akış sitometresine sokun. Özel bir çalışma sayfasında FSC ve SSC yoğunluklarını tanımladıktan sonra hücre sinyallerini yakalayın. Grafikte X ekseni için FSC'yi ve Y ekseni için SSC'yi seçin.
Eksen üzerinde bir kapı oluşturmak için ilgilenilen popülasyonun etrafına bir çokgen çizin. Geçitli popülasyonu kullanarak yeni bir çizim oluşturmak için, X eksenini floresan sinyali 1'e ayarlayın. Hücre-mikroRNA tespiti ve EV-mikroRNA tespiti için Y ekseni - floresan sinyal 2 için.
Floresan etiketli mikroRNA'ların her biri ile bağımsız olarak transfekte edilmiş hücreleri kullanarak tek tek floroforlar için kompanzasyon parametreleri oluşturun. Hücre-mikroRNA ve EV-mikroRNA ile transfekte edilen hücrelerin akış sitometrisi analizi, EV-mikroRNA'ya karşılık gelen floresan sinyalinde sıralı bir azalma olduğunu ortaya çıkardı. Buna karşılık, hücre-mikroRNA'ya karşılık gelen sinyal hücrelerde tutuldu, bu da floroforun mikroRNA'ların hücreler tarafından tutulmasını etkilemediğini gösteriyor.
