Başlamak için, Calu6 hücrelerinden izole edilmiş, floroforla konjuge EV-mikro RNA ve hücre-mikro RNA ile transfekte edilmiş EV'leri alın. Akış sitometrisi analizi için hücre dışı vezikül süspansiyonunu hazırlamak için EV'leri uygun bir hacimde ultra filtrelenmiş PBS ile seyreltin. Nano boyutlu parçacıkları analiz etmek için nano akış sitometresini kullanın.
Yazılımı başlatın ve cihazı önerilen kalibrasyon talimatlarına göre yapılandırın. Performans nano boncuklarını kullanarak performans testini gerçekleştirin. Nano boncuklar standart boyut aralığında tespit edilirse cihazın performansı optimal kabul edilir.
EV partikül tespiti için uygun akış hızını belirleyin. Şimdi, cihazların akışkanlarını doğrulamak ve dedektörlerin ve lazerlerin performansını değerlendirmek için ultra saf filtrelenmiş su kullanarak bir kalite kontrol kontrolü gerçekleştirin. Üreticinin protokolüne göre boncuk karışımındaki farklı popülasyonların hassasiyetini ve çözünürlüğünü değerlendirmek için parametreleri yapılandırın.
Ardından, boncuk popülasyonunu enstrüman gürültüsünden ayırt etmek için uygun geçitleme uygulayın. Ardından, analiz için yüklemeden önce EV'lerin eşit dağılımını sağlamak için numuneleri iyice vorteksleyin. Akış sitometrisi veri analizi yazılımını başlatın ve ultra filtreli PBS'yi tanıtın.
Ultra filtrelenmiş PBS kullanarak, EV parçacıkları için geçit kurun ve geçitin kalibrasyona dayalı olarak uygun partikül boyutuna karşılık gelmesini sağlayın. Uyumlu bir tüpe aktarılmış ve girdaplanmış EV'leri alın ve tüpü cihaza yükleyin. X ekseninde FSC'yi ve y ekseninde SSC'yi çizerken EV sinyallerini yakalayın.
X ekseninde hücre mikro RNA algılaması için floresan sinyali 1'i seçin ve y ekseninde EV mikro RNA algılaması için floresan sinyali 2'yi seçin. Tek bir mikro RNA ile transfekte edilmiş hücrelerden izole edilen EV örnekleri kullanılarak. Floroforlar için belirlenmiş kompanzasyon parametreleri.
Akış sitometrisi, verimli paketleme ve salmayı destekleyen EV'lerde zamana bağlı bir miR-451a, Alexa fluor-488 birikimini ortaya çıkardı. Buna karşılık, EV'lerde miR-67 hücresinin floresansı gözlenmedi.
