G/I kuyruğuna başlamak için, toplam RNA, kuyruk tampon karışımı ve kuyruk enzim karışımı ile buz üzerinde 20 mikrolitrelik bir karışım hazırlayın. Bir termocycler'da 37 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin. Ardından, kuyruk durdurma solüsyonunu ekleyin ve iki dakika buz üzerinde tutun.
Ters transkripsiyon ve PCR amplifikasyonu gerçekleştirin. PCR ürünlerinin yüksek çözünürlüklü jel elektroforezinden sonra, yazılımı kullanarak verilere erişin. XAD dosyasını açın ve Ağaç Görünümü panelinde örnek adları veya merdiveni seçin.
Ayrıntılı görüntüleme için elektroferogramları ve jel benzeri görüntüleri yakınlaştırın ve uzaklaştırın. En yüksek boyutları elde etmek için, seçilen bir numunenin elektroferogramını açın. Elektroferograma sağ tıklayın ve yatay çizgiyi sürükleyerek tepe noktalarını manuel olarak seçmek için manuel entegrasyonu seçin.
Tepe tablosundaki tepe değerlerini gözlemleyin ve en büyük tepe yüksekliğine sahip tepe noktasını belirleyin. Üst menüdeki Ayar Noktalarını Göster/Gizle simgesini etkinleştirin. Sağ tarafta yeni bir panel açılacaktır.
Gelişmiş'i seçin, Smear Analizi Gerçekleştir'e gidin ve onay kutusunu seçin. Bu, Bölge tablosunu Elektroferogram sekmesine ekleyecektir. Ardından bir elektroferogram seçin ve Bölge tablosuna gidin.
Baz Çiftinden ve Baz Çiftine menüsünde, elektroferograma sağ tıklayarak ve eklenecek bir bölge seçerek başlangıç ve bitiş baz çiftini ayarlayın. Bölge tablosundaki herhangi bir hücreye sağ tıklayın ve özel bölgeler ayarlamak üzere küçük bir yeni pencere açılır penceresi oluşturmak için Bölgeleri Değiştir'i seçin. İlgilenilen mRNA'daki poli(A)kuyruk uzunluğunu hesaplamak için bu denklemi kullanın.
Ardından, Elektroferogram sekmesinde, Bölge tablosunu temel çiftten çalışma zamanına otomatik olarak dönüştürmek için Boyutları Göster'i işaretleyin. CSV dosyasını açın ve bir grafik oluşturmak için çalışma zamanı için elde edilen değerleri seçin. Bu protokol kullanılarak, Drosophila larva beyinlerinden Dscam1 ve GAPDH genlerinin poli(A)kuyruk uzunlukları analiz edilirken, gen spesifik primer çiftlerinden elde edilen PCR ürünleri tek bir bant gösterdi.
Gene özgü üniversal primer çiftlerinden elde edilen PCR ürünleri, mRNA'ların diferansiyel poli(A) uzunluğunu gösteren farklı yayma paternleri gösterdi. Ortalama poli(A) kuyruk uzunlukları smear analizi kullanılarak elde edildi. Ve kuyruk uzunluklarının aralığı elektroferogramlarla temsil edildi.
Benzer şekilde, S2 hücreleri üzerinde poli(A)kuyruk uzunluğu analizi, SV43 asal UTR ve GAPDH genleri için diferansiyel poli(A)kuyruk uzunlukları gösterdi.
