Başlamak için, canlı bir Caenorhabditis elegans'ta DA9 aksonunun asinaptik bölgesinde endojen GFP Rab3'ün bir zaman atlamasını kaydedin. Timelapse veri dosyasını Fiji içine aktarın. Ardından, görüntü alımı sırasında hayvanın veya akson segmentinin hareketini veya hafif kaymasını kontrol edin.
Herhangi bir hareketi veya sürüklenmeyi düzeltmek için sert bir gövde dönüştürme seçeneğine sahip StackReg eklentisini kullanın. Segmentli çizgi aracını kullanın ve çizgi genişliğini akson çapına uyacak şekilde ayarlayın. Analiz için akson segmenti boyunca bir çizgi çizmek için segmentli çizgi simgesine farenin sol tuşu ile çift tıklayın.
Şimdi Fiji eklentisi KymoResliceWide'ı kullanarak, parametre ayarlarında çizginin genişliği boyunca maksimum yoğunluk değerini ayarlayarak kymografı oluşturun. Düz çizgi aracını kullanarak, taşıma olaylarını kymografta izleyin. tek tek taşıma olaylarını izleyin ve her satırı ROI yöneticisine kaydedin.
Fiji'de alan, sınırlayıcı dikdörtgen, ortalama gri değer ve Feret çapı gibi ölçüm parametrelerini seçin. Ardından, sonuç tablosunu hesaplama için bir elektronik tabloya yapıştırın. Çalışma uzunluğunu mikrometre cinsinden elde etmek için genişliği kameranın çözünürlüğüyle çarpın.
Bir hareket olayının süresini belirlemek için, yüksekliği ardışık zaman noktaları arasındaki alım süresiyle çarpın. Duraklama süresini, hızın sıfır olduğu iki ardışık hareket arasındaki çalışma süresi olarak hesaplayın. Toplam olayları, dakika başına olay sayısı ve akson uzunluğu segmenti için kymografın toplam uzunluğuna normalleştirin.
Gelincik açısı aracını kullanarak, olayları anterograd ve retrograd taşıma olarak kategorilere ayırın. Segmentli çizginin proksimalden distale doğru çizilmesiyle oluşturulan kimografiler için, her olayın yönlülüğünü belirlemek için Feret açısını kullanın.
