Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir.

live

Speed

×

MEDIA_ELEMENT_ERROR: Format error

Halo etiketli proteinlerin etkileşimlerini incelemek için tek moleküllü görüntüleme verilerinin analizi

Transkript

1 Başlamak için,HaloTag protein kondensatlarının canlı hücre 2 tek molekül görüntülemesini gerçekleştirin. 3 ImageJ'yi kullanarak, ham görüntüleme veri dosyasındaki 5 her kanalı 4 bağımsız bir TIFF dosyasına dönüştürün. 6 Gerekirse, ön izleme tarağını çalıştırın.

metin 7 ve istemleri izleyin 8 herhangi bir çerçeveyi en yeni olanlarla değiştirmek için. 9 Film dosyasının tek molekülünü SlimFast'e yüklemek için, yükle'ye 10 tıklayın, ardından görüntü yığınına tıklayın. 11 İlgili seçenek sayfaları altında yerelleştirme 12 ve edinme parametrelerini ayarlayın.

13 Tüm moleküllerin lokalizasyonlarını görselleştirin. 14 Ve tümünü kilitle'yi kullanarak, 15 her karedeki tüm moleküllerin 16 lokalizasyonlarını içeren bir dosya oluşturun. 17 Ardından, parçacık verilerini 18 yükle'ye gidin ve yerelleştirme ve edinme ayarlarıyla 19 dosyasını yüklemek için SlimFast'i seçin.

20 Seçenek ve sayfa izlemeyi kullanarak, 21 yörünge oluşturma parametrelerini ayarlayın. 22 Tüm moleküllerin yörüngelerini içeren bir dosya 23 oluşturmak için gen traj'a tıklayın. 24 Sayfa izlenen dosyayı eval SPT 25'e yükleyin ve 26 saniyeden daha kısa yörüngeleri filtrelemek için parametreleri 2.5 ayarlayın.

27 Dışa aktarma verilerini kullanarak, filtrelenmiş tüm yörüngeleri içeren bir dosya 28 oluşturun. 29 ImageJ makro, çekirdek, 30 ve küme maskesi sürüm iki'yi çalıştırma. metin, 31 eşik filmin tüm kareleri elde edildi 32 JFX549 kanalında hızlandırılmış bir film oluşturmak için 33 zaman gelişen ikili maske ile doldurulmuş 34 yoğunlaşma konumlarını vurgulayan.

35 Convert ASCII yavaş izleme CSS'sini kullanma 3. M, 36, yörüngeleri 37 yeniden biçimlendirir ve kategorizasyon sürüm 4'ü çalıştırır. M 38, bir molekülün bir kondensatta geçirdiği 39 kullanım ömrüne göre sıralamak için.

40 Ardından, arsa ikametgahı hist CSS'yi kullanarak. M, 41, spesifik olarak bağlı moleküllerin 43 gözlenen ayrışma hızını 42 ve ilgilenilen kondensat 44 proteininden ve H2B yörüngelerinden fotoağartma oranını çıkarır. 45 Son olarak, özellikle kondensatlarına bağlı olan 47 ilgilenilen proteinin düzeltilmiş ortalama kalış süresini 46 hesaplayın.

48 TAF15 IDR-Halo-FTH1'in iki renkli tek moleküllü filminden 49 alınan bir kare, hem PA-JF646 hem de JFX549 kanallarında çekirdekten 50 sinyallerini gösterir. 51 Montaj ve sıralama üzerine, 52 PA-JF646'nın tespit edilen moleküllerinin 53 kondensatlara bağlı yörüngeleri için net bir ayrım gözlendi. 54 Fotoağartma 56 için düzeltmeden sonra hesaplanan ortalama kalma süreleri 55, TAF15-Halo-FTH1 için Halo-TAF15'ten daha fazlaydı.

Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz

Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.