Başlamak için, bir fareden izole edilmiş femur, tibia, pelvis ve humerus kemiklerini alın. Uzun kemiklerin büyüme plakalarını kesmek için bir neşter kullanın ve epifizi çıkarın. Buz üzerinde M199 medium artı %2 FBS içeren 10 santimetrelik bir tabağa koyun.
Daha sonra, iliği buz üzerinde 15 mililitrelik bir tüpe akıtmak için 28 gauge bir iğne ve M199 ortamı artı% 2 FBS ile doldurulmuş 10 mililitrelik bir şırınga kullanın. Kızarmış kemiği epifizle birlikte tabağa yerleştirin. 15 mililitrelik tüpü ilik yerleşene kadar buz üzerinde dik olarak bırakın.
Daha sonra M199 medium artı %2 FBS'yi çıkarın: 15 mililitrelik tüpe dört mililitre B&M ayrışma kokteyli ekleyin ve 37 derecelik bir su banyosunda inkübe edin. İnkübasyondan sonra, süpernatanı toplayın ve 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik soğuk bir tüpe süzün. Kalan kemik iliği peletine iki mililitre taze B&M ayrışma kokteyli ekleyin ve su banyosuna geri koyun.
Bir mililitrelik bir pipet kullanarak, kalan kemik iliği parçalarını kuvvetlice pipetleyin. Tüm hücre süspansiyonunu daha önce olduğu gibi aynı tüpte toplayın. Hücre süspansiyonuna% 0.5 BSA ile 20 mililitre M199 ortamı ve iki milimolar EDTA ekleyin.
Daha sonra, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 G'de santrifüjleyin. Peletleri 500 mikrolitre PBS'de% 0.5 BSA ve biyotin antikorları ile yeniden süspanse edin. Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
Ardından, manyetik boncukları iyice girdaplayın. Tüpe 25 mikrolitre boncuk ekleyin ve orbital çalkalayıcı üzerinde tekrar inkübe edin. Tüpü iki ila üç dakika boyunca eşleşen bir mıknatısa yerleştirin ve süpernatanı yeni bir tüpte toplayın.
50 mililitrelik bir tüpün düz kapak ucunu kullanarak kemikleri 10 santimetrelik tabakta daha küçük parçalara ayırın. Kemik parçalarını izole etmek için süpernatanı 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün. Hücre süzgecindeki kemik parçalarını makasla kesin.
Filtreyi kemik parçalarıyla birlikte 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve filtreyi neşterle açın. Cımbızla, kemik fraksiyonunu beş mililitre murin B&M ayrışma karışımına aktarın. Daha sonra tüpü yatay olarak 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin ve 120 RPM ile 30 dakika çalkalayın.
Sindirimden sonra,% 0.5 BSA ve iki milimolar EDTA ile 25 mililitre M199 ortamı ekleyin. Stromal hücreler içeren süpernatanı 70 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik soğuk bir tüpe süzün.
