Başlamak için, Flor eksprese eden Trypanosoma brucei hücreleri üzerinde akış sitometrisi yapın. Yeni bir düzen açın ve alınan FCS dosyalarını düzen penceresine sürükleyip bırakın. Canlı hücrelerin geçitini yapmak için, bir pencere açmak üzere boyanmamış vahşi tür denetimini seçin.
YL2H veya RL2H kanalındaki histogramları kullanarak verileri analiz edin. Bu durumda, numuneler propidyum iyodür ile boyandığından bir YL2H histogramı kullanın. Ardından, canlı ve ölü hücreleri ayırmak için bir açıortay kapısı oluşturun, sol kapıyı canlı ve sağ kapıyı ölü olarak etiketleyin.
Bu kapıyı tüm örneklere uygulayın ve ayarlayın. Kapıyı veri kümesindeki birden çok örnekte görüntüleyerek kapının düzgün çizildiğinden emin olun. Boyanmamış vahşi tip kontrolde, canlı kapıya çift tıklayın.
Nokta grafiğinin X eksenini ileri dağılım alanına, Y eksenini de yan dağılım alanına ayarlayın. Ardından, hücre popülasyonunu ana hatlarıyla belirtmek ve hücreleri etiketlemek için Polygon kapısı aracını kullanın. Nokta grafiğindeki tipik konumları konusunda dikkatli olarak enkaz veya ölmekte olan hücreleri ve agregaları hariç tutun.
Tüm numuneler için canlı kapının altına hücre geçidini uygulayın ve tüm numuneler için olası hücre popülasyonunu kapsadığından emin olun. Bu geçit içindeki olayları görüntülemek için boyanmamış vahşi tür denetimdeki hücre geçidine çift tıklayın. Nokta grafiğini ayarlamak için, X eksenini ileri dağılım alanına, Y eksenini de ileri dağılım yüksekliğine ayarlayın.
Bu nokta grafiğindeki tek hücrelerin diyagonal dağılımını tanımlayın ve bunları çiftlerden ayırt edin. Singlet olaylarını çevrelemek için Polygon kapısı aracını kullanın ve bu geçit singlet'lerini adlandırın. Tüm numuneler için hücre kapısının altına tekil kapısını uygulayın, tekliler dahil ederken çiftleri hariç tuttuğundan emin olun ve kapıyı farklı numuneler arasında gerektiği gibi ayarlayın.
Boyanmamış vahşi tip kontrol örneğinde, tekil kapısına çift tıklayın. Nokta grafiğinin X eksenini BL1H ve Y eksenini VL2H olarak değiştirin. Çokgen kapısı aracını kullanarak, VL2 ve BL1'deki Flor-2 floresan hücrelerini yakalamak için çapraz bir geçit çizin.
Bu kapıyı pHL pozitif olarak etiketleyin. Tüm numuneler için tekli kapının altına pHL pozitif kapısını uygulayın. Vahşi tip kontroldeki otofloresan hücrelerden daha yüksek floresan yoğunluğuna sahip hücreleri kapsayacak şekilde pHL kapısını ayarlayın.
İstatistikleri dışa aktarmak için tablo düzenleyiciye, ardından düzenleme çubuğuna tıklayın ve son olarak sütun ekle'yi seçin. Toplam açılmamış sayım, pHL pozitif sayımı, toplamın canlı frekansı, ebeveynin pHl pozitif frekansı, pHL pozitif medyan VL2H ve pHL pozitif medyan BL1H için sütunları birleştirin. Tablo düzenleyicide dışa aktarma ayarlarını yapmak için display (Görüntü) öğesini Dosya ve Metin öğesini CSV olarak ayarlayın.
Dosya hedefini ve adını seçin, ardından tablo oluştur'u tıklayın. Açlığa yanıt olarak zamanla kademeli hafif bir asitlenme gözlendi ve bu da 90 dakika boyunca durağanlaştı. Yeşil çizgi ile gösterildiği gibi glikozu yeniden verdikten sonra, glikozomal pH 30 dakika içinde açlık öncesi seviyelere geri döndü, bu da glikozomal pH'ın glikoza yanıt olarak dinamik ve düzenlenebilir olduğunu düşündürdü.
