Başlamak için, 100 milimetrelik bir kültür kabına ham 264.7 hücre ekleyin ve 37 santigrat derecede% 95 nem ve% 5 karbondioksit ile altı mililitre DMEM ile inkübe edin. Hücreler% 80 birleşme seviyesine ulaştığında, eski ortamı aspire edin, ardından hücreleri oda sıcaklığına ısıtılmış iki mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücre içeren her bir tabağa iki mililitre PBS ekleyin ve karıştırın.
Hücreleri iki adet 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne toplayın, ardından oda sıcaklığında üç dakika boyunca 377 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri iki mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Şimdi, mikrosantrifüj tüplerini beyaz katı oluşana kadar sıvı nitrojen içinde dondurun ve hemen 37 santigrat derece su banyosunda çözdürün.
Tüpleri 12.000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, biri 100 mikromolar Ksantatin ve diğeri eşit hacimde dimetil sülfoksit içeren iki mikrosantrifüj tüpü alın. Her tüpe 450 mikrolitre santrifüjlenmiş süpernatan ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Daha sonra her bir mikrosantrifüj tüpünden 60 mikrolitre süpernatanı 14 PCR tüpüne aktarın. Tüpleri, her sıcaklıkta iki PCR tüpü ile üç dakika boyunca değişen sıcaklıklarda aynı anda ısıtın. Ardından tüpleri santrifüje yerleştirin.
Şimdi, her tüpten 48 mikrolitre süpernatan alın ve yeni bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Her tüpe 12 mikrolitre SDS-PAGE protein yükleme tamponu ekleyin. Girdaplanmış numuneleri 100 santigrat derecede bir su banyosunda beş dakika ısıtın.
