Başlamak için SDS-PAGE jelini hazırlayın. Çözülmüş işaretleyiciyi ve hazırlanan hücresel termal kayma tahlil örneklerini döndürün. İlk kuyucuğa 2,5 mikrolitre işaretleyici ve kalan kuyucukların her birine 20 mikrolitre numune ekleyin.
Ardından, jeli 80 voltta çalıştırın. Daha sonra, bir behere 850 mililitre ultra saf su, 100 mililitre susuz etanol ve 50 mililitre hızlı transfer tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. Poliviniliden florür veya PVDF membranını jelin boyutuna göre kesin ve işaretleyin.
Ardından, etkinleştirmek için 30 saniye metanolde bekletin. Transfer kelepçelerini, sünger pedi ve üç kat transfer filtre kağıdını transfer tamponunu içeren bir tepsiye yerleştirin. Elektroforez tamamlandıktan sonra, elektroforez solüsyonunu elektroforez cihazından boşaltın ve plakayı çıkarın.
Jeli plastik bir bıçakla nazikçe çıkarın ve protein işaretleyicisini ve hedef proteinleri net bir şekilde görselleştirmek için kesin. Jeli transmembran solüsyonunda yıkadıktan sonra, filtre kağıdının üzerine düz bir şekilde yerleştirin. Aktive edilmiş PVDF membranını transfer çözeltisine batırın.
Etiketli tarafı cımbızla tutun ve jeli yüzü aşağı bakacak şekilde kapatın. Ardından, monte edilmiş transfer kurulumunu transfer tankına yerleştirin. Kalan transmembran çözeltisini transmembran kasetine ekleyin.
Akımı ve saati ayarlayın ve aktarımı oda sıcaklığında başlatmak için çalıştır düğmesine basın. Şimdi, inkübasyon kutusuna TBST ile altı mililitre% 5 BSA çözeltisi ekleyin. Aktarım tamamlandıktan sonra, işaretleyici tarafını sıkıştırırken PVDF membranını kurulumdan çıkarın ve inkübasyon kutusuna yerleştirin.
BSA çözeltisini inkübatör kutusundan çıkardıktan sonra, altı mililitre birincil antikor ekleyin. Kuluçka kutusunu, çalkalarken gece boyunca buz paketleri içeren bir köpük kutuya yerleştirin. Ertesi gün, birincil antikoru bir tüpte toplayın ve zarı altı mililitre TBST çözeltisi ile yıkayın.
Daha sonra, inkübasyon kutusuna altı mililitre ikincil antikor ekleyin. İnkübasyonun sonunda, ikincil antikoru toplayın ve zarı daha önce gösterildiği gibi TBST ile beş kez yıkayın. Eşit hacimlerde kemilüminesan reaktifler A ve B'yi karıştırın.
Numunelere tıklayın, kalibrasyonu kontrol edin ve kalibrasyonun tamamlanmasını bekleyin. Ardından, işaretleyiciye tıklayın ve kalibrasyonu kontrol edin. Şimdi şeridin işaretleyici tarafını cımbızla alın ve kemilüminesan reaktif çözeltisine tamamen daldırın.
Şeridi görüntüleyiciye yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirmek için işaretleyicinin bir tarafını sıkıştırın ve görüntüleyicinin kapağını kapatın. Pozlama süresini bir saniyeye ayarlayın ve Yakala'yı tıklayın. Kaydet'i tıklayın.
Görüntüyü adlandırın ve bir TIFF dosyası olarak kaydedin. Hücresel termal kayma testi, Ksantatinin, dimetil sülfoksit grubuna kıyasla 48 ila 57 santigrat derece sıcaklık aralığında Keap1 proteininin termal stabilitesini önemli ölçüde değiştirdiğini gösterdi.
