Başlamak için 10 mililitre 2X AlkB reaksiyon tamponu hazırlayın ve 0.2 mikronluk bir şırınga filtresinden sterilize edin. Steril bir PCR tüpünde, 20 mikrolitre bağlayıcı 1-bağlı RNA, 50 mikrolitre 2X AlkB reaksiyon tamponu, iki mikrolitre AlkB demetilaz, bir mikrolitre RNA inhibitörü ve 27 mikrolitre RNA serbest su ekleyin AlkB sindirim reaksiyonunu hazırlamak için. RNA'lardan transkripsiyon sonrası metilasyonu çıkarmak için AlkB sindirim karışımını oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.
Temiz faz ayrımı için, AlkB reaksiyonuna 50 mikrolitre RNA içermeyen su ekleyin. Ardından 100 mikrolitre fenol, kloroform ve izoamil alkol karışımı ekleyin. Tüpü 10 saniye çalkalayın.
AlkB karışımını 16.000G'de 10 dakika santrifüjleyin. Üst sulu tabaka içeren RNA'ların yaklaşık 140 mikrolitresini steril 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Artık fenolü çıkarmak için, ekstrakte edilen RNA'lara 100 mikrolitre kloroform ekleyin ve tüpü sallayın.
Karışımı 16.000G'de 10 dakika santrifüjleyin ve üst sulu tabakanın yaklaşık 120 mikrolitresini steril 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ters transkripsiyon reaksiyonundan sonra, RNA cDNA hibritine bir mikrolitre beş molar sodyum hidroksit ekleyin. RNA cDNA hibritinin RNA zincirini hidrolize etmek için 93 santigrat derecede üç dakika inkübe edin.
Ardından, reaksiyonu nötralize etmek için 0.77 mikrolitre beş molar hidroklorik asit ekleyin. TAE tamponunda %3'lük bir agaroz jeli hazırlayın. Bir mikrolitre 6X yükleme boyasını beş mikrolitre PCR ürününe karıştırın ve jeli karışımla doldurun.
Beş mikrolitre 50 veya 100 baz çifti DNA merdivenini ilk numuneden önce kuyuya ve son numuneden sonra kuyuya yükleyin. PCR ürünlerini bulmak için 120 dakika boyunca 400 volt ve 75 miliamperde jel elektroforezi çalıştırın. Elektroforezden sonra jeli bir kutuya koyun ve jel tamamen daldırılana kadar deiyonize su ile doldurun.
Suya 10 mikrolitre etidyum bromür ekleyin. Kutuyu folyo ile sarın ve bir çalkalayıcı üzerinde 30 dakika lekeleyin. Etidyum bromür içeren suyu, çeker ocak içine yerleştirilmiş bir atık şişesine atın.
Jeli deiyonize suyla bir kez durulayın ve suyu bir atık şişesine atın. Jeli deiyonize su ile 10 dakika yıkadıktan sonra, bantları görselleştirmek ve jelin yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü elde etmek için bir jel görüntüleyici kullanın.
