Başlamak için, nöral krest indüksiyonuna tabi tutulmuş 12 günlük insan pluripotent kök hücre kültürlerini alın. Hücrelerden C ortamını nazikçe aspire edin. Hücreleri yıkamak için kuyu yüzey alanının santimetre karesi başına 100 mikrolitre PBS ekleyin ve ardından PBS'yi çıkarın.
Hücrelere eşit hacimde hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit takviyesi altında 30 dakika inkübe edin. Plakaya eşit hacimde NCC ortamı ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu hasat etmek için serolojik bir pipet kullanın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Hücreleri 290G'de 20 ila 25 santigrat derece arasında iki dakika döndürün. Hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice atın. Hücre peletine 12 mililitre NCC ortamı pipetlemek için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın.
Bir süspansiyon oluşturmak için süspansiyonu mekanik olarak yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu ultra düşük bir bağlantı plakasına aktarın. 14. günde, her bir oyuğun merkezinde küçük sferoidleri toplamak için hücre kültürü plakalarını hafifçe döndürün.
Harcanan ortamı her bir oyuğun çevresinden yavaşça aspire etmek için bir P1000 mikro pipet kullanın. Hücreleri orijinal NCC ortamı hacmiyle yeniden besleyin. 15. günde, ortamı dikkatlice çıkarın.
Sferoidleri yıkamak için kuyulara PBS ekleyin. Ardından, sferoidlerin rahatsız edilmediğinden emin olarak mümkün olduğunca fazla PBS'yi çıkarın. Daha sonra, kuyu yüzey alanının santimetre karesi başına 100 mikrolitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin.
Çözeltideki hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit altında 30 dakika inkübe edin. 10 mililitrelik bir serolojik pipet ile her oyuğa eşit hacimde ENC ortamı ekleyin. Kalan sferoidleri kırmak için çözeltiyi mekanik olarak pipetleyin.
Daha sonra hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha önce olduğu gibi santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın. Daha sonra, hücreleri 5 ila 10 mililitre ENC ortamında yeniden süspanse edin.
Tripan mavisi ve hemositometre kullanarak canlı hücrelerin konsantrasyonunu sayın. Şimdi, yüzey alanının santimetre karesi başına yaklaşık 300.000 ila 400.000 canlı hücre ve mililitre başına yaklaşık 1 milyon hücre yoğunluğu için yeterli miktarda ENC ortamı ekleyin. Ardından, çözeltileri kuyulardan aspire edin.
Daha sonra, hücreleri PO / FN laminin kaplı oyuklara sahip bir plakaya ekleyin. Hücreleri her gün, 30 ila 40 güne kadar kuyu yüzey alanının santimetre karesi başına 200 mikrolitre ENC ortamı ile besleyin. Nöral kret indüksiyonundan sonra pürüzsüz yüzeylere sahip yüksek kaliteli serbest yüzen küreler gözlendi.
Sferoidler, nöral krest işaretleyici SOX10'u ifade etti. Enterik nöron indüksiyonu sırasında 25 ila 30. günler arasında nöritler gözlendi.
