Her numune için bir mililitre LB suyu ve bir LB artı gentamisin agar plakasını önceden ısıtın ve 37 santigrat dereceye ayarlanmış statik bir inkübatörde kontrol edin. Beş mikrolitre veya daha az birleşik bir hacimde, her biri 100 ila 200 nanogram pTNS2 yardımcı plazmidi ve pUC18-Tmini-Tn7-Tlac gentamisin adeIJK yerleştirme plazmidini elektroyetkin hücrelerin bir alikotuna ekleyin. Plazmitlerin elektroyetkin hücrelerle kabarcıklar oluşturmadan tam olarak karışmasını sağlamak için parmak ucuyla hafifçe vurarak karıştırın.
Negatif kontrol hücresi alikotuna eşdeğer hacimde steril damıtılmış su ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi hafifçe karıştırın. Numuneleri buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. Tüm hücre örneğini buz gibi bir elektroporasyon küvetine aktarın ve ardından küveti tekrar buzun üzerine yerleştirin.
Hücre örneğini elektropolasyon yapmak için elektroporatörü açın ve iki kilovolta ayarlayın. Yapışan buz veya nemi gidermek için küvetin yüzeyini yumuşak bir bezle silin. Küveti elektroporatöre yerleştirin ve elektrik çarpmasını sağlayın.
Küvetteki hücrelere hemen 0,9 mililitre önceden ısıtılmış LB suyu ekleyin ve hücreleri ortamla karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Tüm hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında yeni bir 1,5 mililitrelik mikrofüj tüpüne aktarın. Ardından elektroporatördeki zaman sabiti değerini kontrol edin.
En iyi sonuçlar için bu değer dört ile altı arasında olmalıdır. Hücre geri kazanımına izin vermek için elektroporasyonlu numuneleri 37 santigrat derecede 250 RPM'de bir saat inkübe edin. Bir saat sonra, bir aşılama yayıcı kullanarak her numuneden 100 mikrolitreyi önceden ısıtılmış bir LB artı gentamisin agar plakasına yayın.
Plakaları 37 santigrat derecede 16 ila 18 saat inkübe edin. Elektroporasyon plakalarını kontrol edin. Steril kürdan kullanarak, LB artı gentamisin agar plakalarından 10 adede kadar tek koloni alın ve bunları taze bir LB artı gentamisin agar plakasına yamalayın.
Plakaları 37 santigrat derecede 16 ila 18 saat inkübe edin. Dönüşüm plakası kolonilerinin seçici ortama yamalanması, dönüştürülmüş suşu korur ve koloni PCR taraması için başlangıç materyali sağlar. Tarama primerleri için PCR ürünü, ABglmS2 ileri yeni ve Tn7 ters 382 baz çiftidir.
Reaksiyon için negatif kontroller arasında vahşi tip A.baumannii ATCC 17978, AB 258 bulunur ve şablon yoktur.
