Başlamak için, etiketlenmiş fare miyoblast örneklerini içeren örnek tüplerine 150 mikrolitre etiketleme tamponu ekleyin. Her tüpe EDTA, SDS ve proteinaz K pipetleyin. İyice karıştırmak için tüplerin içeriğini girdaplayın, ardından tüpleri bir PCR makinesinde iki saat boyunca 55 santigrat derecede inkübe edin.
Ardından, her bir numuneyi 200 mikrolitre fenol-kloroform karışımı içeren 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine pipetleyin. Tüplerin içeriğini karıştırmak için girdaplayın. Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, üst katmanı yeni bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın.
Daha sonra tekrar vorteksleme ve santrifüjlemeden önce yeni tüplere 200 mikrolitre kloroform ekleyin. Üst tabakayı yeni bir tüpe aspire edin. Şimdi her numune tüpüne 550 mikrolitre %100 etanol ekleyin ve ters çevirerek iyice karıştırın.
Daha sonra DNA çökelmesini sağlamak için tüpleri bir saat boyunca eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin. Bir DNA peleti elde etmek için çözeltiyi 15 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. Süpernatanı döktükten sonra, tekrar beş dakika santrifüjlemeden önce peleti %75 etanol ile yıkayın.
Daha sonra peleti 21 mikrolitre çift damıtılmış suda tekrar süspanse edin. Kütüphane hazırlığı için kullanılacak PCR'yi ayarlayın. Her numune için farklı bir N7XX Illumina astarı ve evrensel bir N5XX astarı kullanın.
PCR'yi çalıştırmak için PCR döngü numarasını cihaza girin. Amplifikasyondan sonra, agaroz jeller üzerindeki kütüphanelerin üç mikrolitresini elektroforez. CUT & Tag kütüphaneleri çoğunlukla yaklaşık 300 baz çiftinden oluşan etiketli mononükleozomlar içeriyordu.
qPCR, H3K4me1 işaretinin MYOD1 geninin arttırıcı bölgelerinde oldukça zenginleştirilmiş olduğunu gösterdi.
