Yer fıstığı tohumlarının kuluçkadan geçirilmesinden sonra, Aspergillus flavus spor aşılamasını takiben, tohum parçalarını agardan çıkarmak için forseps kullanın. Tohum parçalarını, 13 zirkonyum seramik boncuk içeren etiketli yedi mililitrelik boncuk şişelerine yerleştirin. Fitoaleksin ve aflatoksinlerin ekstraksiyonu için, tohum boyutuna bağlı olarak, boncuk şişesine iki veya dört mililitre metanol su karışımı ekleyin ve 45 saniye boyunca saniyede 5,5 metre hızla toz haline getirin.
Daha sonra üç dakika boyunca 1.860 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı taze bir şişede toplayın. Aflatoksin analizi için, 90 derecelik bir açıyla kesilmiş bir cam çubuk kullanarak, 1,5 mililitrelik bir polipropilen kolona polietilen gözenekli bir frit yerleştirin. Özel yapım bir kepçe ile sütuna 50 miligram magnezyum silika jel ekleyin.
Sütunu aynı frit ile kapatın ve bir cam çubukla aşağı doğru itin. Özel paketlenmiş mini kolona 0,5 mililitre süpernatan ekleyin ve ekstraktın yerçekimi ile dört mililitrelik bir cam şişeye akmasına izin verin. Yerçekimi ile kirleri aynı şişeye yıkamak için kolona bir mililitre metanol su karışımı ekleyin.
Kombine elüatları flakondan attıktan sonra, aflatoksin fraksiyonunu temiz bir cam şişeye elüte etmek için kolona 1.2 mililitre aseton asetil nitril su,% 88 formik asit karışımı ekleyin. 45 santigrat derecede bir ısıtma bloğunda bir nitrojen akışında flakondaki çözücüyü buharlaştırır. Buharlaştıktan sonra, şişeyi kapatın ve bir dakika boyunca ezilmiş zarlarda soğutun.
Özel yapım Pasteur pipet filtrelerini tek kullanımlık test tüplerine yerleştirin ve filtrasyon sırasında buharlaşmayı en aza indirmek için buzun üzerine koyun. Kuru kalıntıyı 0.25 ila 1.0 mililitre metanol su karışımını hassas bir şekilde ölçün. Girdaplamadan sonra, filtreye 0.2 mililitrelik bir alikot aktarın.
400 mikrolitrelik otomatik numune alma cihazı şişesine filtrelemeyi hızlandırmak için nitrojen gazı kullanın. Şişeyi UPLC otomatik numune alma cihazına yerleştirin ve enjeksiyon hacmini 0,1 ila 3,0 mikrolitreye ayarlayın. Fitoaleksin için, yedi mililitrelik santrifüj şişesinden 200 mikrolitre süpernatanı bir Pasteur pipet filtresine aktarın.
Filtrasyondan sonra, şişenin üzerine politetrafloroetilen septum içeren uygun bir kapak yerleştirin. Aflatoksinlerin ayrılması için, belirli yüzde bileşimleri ve çalışma süreleri ile su, metanol ve asetil nitril kullanarak bir gradyan uygulayın. Akış hızını dakikada 0,45 mililitre ve çalışma süresini 9,5 dakikaya ayarlayın.
Sistem kolon ısıtıcısında, kolon sıcaklığını 40 santigrat dereceye ayarlayın. Aflatoksinlerin miktarını belirlemek için, uyarma ve emisyon dalga boylarını sırasıyla 362 ve 440 nanometreye ayarlayın. Ardından, kalibrasyon eğrisi yöntemini ve UPCL yazılım kılavuzunu kullanarak, test numunelerindeki aflatoksin konsantrasyonlarını belirlemek için analizi gerçekleştirin.
Stilbenoidlerin ayrılması için, belirli yüzde koşulları ve süreleri ile su, metanol ve% 88 formik asitten oluşan bir gradyan kullanın. Akış hızını dakikada 0,5 mililitre ve çalışma süresini 12 dakikaya ayarlayın. Kalibrasyon eğrisi yöntemini kullanarak, stilbenoidlerin konsantrasyonlarını belirleyin ve test numunesinin tepe alanlarını saf, otantik standartlarla karşılaştırın.
UPLC bazlı aflatoksin miktar tayini yöntemi, enjeksiyon başına iki pikogram limiti ile aflatoksin B1'in hassas miktar tayinini sağlar. Yabani bir Areca türünden hasat edilen tohumların saflaştırılmış özütü, aflatoksinlerin kesin olarak miktarını gösterdi. Magnezyum silika jel kolonu yaklaşımı, aflatoksin fraksiyonundaki safsızlıkları etkili bir şekilde giderir ve önceki yöntemlerin aksine yüksek miktar tayini verimliliği gösterir.
Ek olarak, bu yöntem aynı zamanda yer fıstığı fitoaleksinlerinin miktar tayinine de yardımcı olur.
