Başlamak için, farklı boya oranları elde etmek için bir PBS çözümüne 500x turuncu boya ekleyin, masaüstünde Veri Toplama yazılımını başlatın. Enstrüman'a tıklayın, ardından ilgili mikroplaka modelini seçin ve Tamam'ı seçin. Edinme ayarlarına tıklayın ve Floresan'ı seçin.
Dalga boyu arayüzü altında, lambda one'ı 470 nanometre ve 570 nanometreye ayarlayın, ardından Tamam'a basın. Turuncu boyanın her konsantrasyonundan 100 mikrolitreyi 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına pipetleyin. Plakayı, floresan mikroplaka okuyucu cihazının algılama aşamasına yerleştirin.
Yazılım üzerindeki Oku simgesine tıklayın ve her boya konsantrasyonunun floresansını oda sıcaklığında iki dakika arayla 13 kez ölçün. Her belirlemeden sonra, Dışa Aktar simgesine tıklayın, ardından XML XLS TXT'ye Dışa Aktar'ı seçin. Tüm Plakaları Seçin.
Ardından çıktı biçiminde Plaka'yı seçin ve daha fazla analiz için verileri XLS biçiminde kaydetmek için Tamam'a tıklayın. Şimdi, dijital ısıtma sallama kuru banyosunu açın. Isıtma sıcaklığını 35 santigrat dereceye ve ısıtma süresini iki dakikaya ayarlayın.
1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde boyanın optimum seyreltme oranını hazırlayın. Daha sonra iki dakika boyunca dijital ısıtma çalkalama kuru banyosuna yerleştirin. Şimdi, hem PBS'den 100 mikrolitre hem de boyama solüsyonlarını plakanın kuyularına ekleyin.
Plakayı cihazın algılama aşamasına yerleştirin. Veri Toplama yazılımındaki Oku simgesine tıklayın. Isıtma sıcaklığını 40 santigrat dereceye ve ısıtma süresini iki dakikaya ayarlayın.
Şimdi, plakadaki boya solüsyonunu 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne geri pipetleyin. Dijital ısıtma sallama kuru banyosunda iki dakika ısıtın. Boya çözeltisinin emilimini 35 ila 95 santigrat derece arasında beş derecelik sıcaklık artışlarında test etmek için elde edilen verileri dışa aktararak boya çözeltilerinin eklenmesini tekrarlayın.
Mikrolitre başına 5, 10, 15 ve 20 mikrogramlık nihai konsantrasyonları elde etmek için CD40 protein çözeltisini PBS ile birleştirin. Daha sonra, 500'e kadar bir nihai konsantrasyon elde etmek için turuncu boyayı PBS ile birleştirin. CD40 protein çözeltisinin emilimini 35 ila 95 santigrat derece arasında beş derecelik sıcaklık artışlarında değerlendirin.
Verileri XLS dosyaları olarak kaydedin, ardından Veri Analizi yazılımını kullanarak erime noktasını veya TM değerini hesaplayın. Ardından, CD40 ve Umbelliferone'u PBS çözeltisine karıştırın. Daha sonra turuncu boyayı PBS'ye pipetleyin ve bir çözelti konsantrasyonu 500'e kadar elde edin.
CD40 Umbelliferone kompleksleri çözeltisinin absorbansını 35 ila 95 santigrat derece arasında beş derecelik sıcaklık artışlarında ölçün. Turuncu boya, hem oda sıcaklığında hem de yüksek sıcaklıklarda sürekli olarak kararlı floresan uyarımı sergiledi. Bir optimal seyreltme oranı 500'e kadar belirlendi.
Mililitre başına 15 mikrogramlık bir konsantrasyonda 51.82 santigrat derecelik stabil bir TM değeri tespit edilebilirdi, bu da CD40 protein konsantrasyonundaki bir artışla 45.79 santigrat dereceye düştü.
