Başlamak için, bir slayt alın ve görüntülemeye hazırlanmak için üzerine iki ince çift taraflı yapışkan bant şeridi ekleyin. Beyin montajı için iki bant şeridi arasına yaklaşık 10 ila 15 mikrolitre montaj ortamı pipetleyin. drosophila beyinleri etiketini, PBS ve% 0.2 Triton X-100 ile önceden durulanmış bir P20 pipet ucu ile bir mikroskop lamına aktarın.
Beyinler aktarıldıktan sonra, anten loblarının yukarı baktığından emin olarak hizalamak için ince bir boya fırçası kullanın. Beyinleri yönlendirdikten sonra, üzerlerini bir cam lamel ile örtün. Ardından, lamel kenarlarını ek montaj ortamı ile doldurun.
Kapak kaymasının kenarlarını şeffaf oje ile kapatın. Slaytı iyice kuruttuktan sonra, sonraki görüntüleme için buzdolabında saklayın. Görüntüleme için 63X yağa daldırma objektifi ile donatılmış bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın.
Bir anten lobunun sinaptik glomerüllerini ve Or42a koku alma duyu nöronlarını görüntülemek için bir argon 488 ve helyum neon 543 lazer kullanın. Her iki kanal için optik kazancı ve ofseti belirleyin. Görüntülemeyi beynin merkezine yerleştirin ve VM7 glomerüllerine odaklanın.
Yaklaşık olarak beynin ortasındaki deliğe kadar bulun. 1024 x 1024 görüntüleme çözünürlüğünü seçin. VM7 glomerüllerinin tam Or42a nöron innervasyonunun yakalandığından emin olmak için anten lobu boyunca tüm bir konfokal Z yığını projeksiyonunu yakalayın.
Genotipi veya durum kör görüntüsünü Fiji'ye yükleyin. Lazer çizgisi kanallarını bölmek için görüntüye gidin, renk'i tıklatın ve kanalları böl'ü seçin. Or42a koku alma duyu kanalında, floresansın başlangıcını ve sonunu belirleyerek hangi dilimlerin Or42a nöron innervasyonunu içerdiğini belirlemek için Z yığınında ilerleyin.
Yalnızca Or42a nöron innervasyonuna sahip dilimleri içeren bir toplam dilim projeksiyonu oluşturmak için görüntüye tıklayın ve yığınlara gidin. Ardından, Z projesine tıklayın, toplam dilimleri seçin ve istediğiniz aralığı girin. VM7 glomerulusundaki Or42a nöron innervasyonunun ana hatlarını izlemek için Fiji'deki kement aracını kullanın.
VM7 sinaptik glomerulus innervasyon hacmini hesaplamak için izlenen alanın çevresini Z yığın dilimlerinin sayısı ve her dilimin kalınlığı ile çarpın. Kontrol kokulu bir araca 24 saat maruz kaldıktan sonra, her iki anten lobunun VM7 glomerüllerinde yoğun Or42a MCD:GFP innervasyonu devam eder. Buna karşılık, %25 EB koku maddesine 24 saat maruz kalma, önemli ölçüde budamaya ve sinaptik glomerüler hacim kaybına neden olur.
Artan EB koku konsantrasyonu, giderek daha fazla sinaptik glomerül budamasına neden olur. Bu EB koku konsantrasyonu aralığı için temsili nicelikler, floresan yoğunluğu ve innervasyon hacmi için benzer sonuçlar göstermiştir.
