Başlamak için, laminer hava akışı kabinini açın ve üç dakika boyunca stabilize olmasına izin verin. Aşağıdaki dezenfeksiyon maddelerini kullanarak kabinin iç yüzeylerini aseptik olarak temizleyin ve sterilize edin. Dolap içerisine girecek herhangi bir malzemeyi dezenfekte ettikten sonra peçete ve nitril eldivenleri kabine yerleştiriniz.
Ardından kabini kapatın ve 15 dakika boyunca ultraviyole ışığa maruz bırakın. Işınlamadan sonra kabini yeniden başlatın. Astar tasarım reaktiflerini buz dolu bir soğutucuya yerleştirin.
%70 etanol ile sterilize ettikten sonra kabı kabinin içine yerleştirin. Döngü aracılı izotermal amplifikasyonu veya LAMP karışımını 0.6 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın. Karışımı homojen hale getirmek için pipetleyin.
Daha sonra, kapalı tüpleri beş dakika boyunca 95 santigrat derecede bir ısıtma bloğunda inkübe edin. Ardından tüpleri buz dolu bir polistiren soğutucuda beş dakika soğutun. Soğuduktan sonra tüpleri laminer akış kabinine yerleştirin.
LAMP karışımını tamamlamak için dört mikrolitre DNA polimeraz ve ardından bir mikrolitre ters transkriptaz ekleyin. Kolorimetrik algılama yapmak için dihidroksinaftol mavisi ekleyin. Reaktif eklendikten sonra, LAMP reaktiflerini uygun şekilde karıştırmak için her bir çözeltiyi pipetleyin.
Daha sonra, kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek 22 mikrolitre solüsyonu PCR tüplerine pipetleyin. Negatif kontrol için, üç mikrolitre% 0.1 dietil pirokarbonat su ekleyin. Genetik materyal ilavesi için kalan tüpleri bir kenara koyun.
Ardından, tüm malzemeleri kabinden çıkarın. Kabin yüzeylerini %70 etanol ile sterilize ettikten sonra kapatın. Ayrı bir alanda, her bir PCR tüpüne üç mikrolitre numune ekleyin ve iyice homojenize etmek için 20 mikrolitrelik bir mikropipet ile iyice pipetleyin.
Kolorimetrik reaksiyonu başlatmadan önce, PCR tüplerinin fotoğraflarını çekmek için yüksek kaliteli bir kamera kullanın. Şimdi, reaksiyonu bir termal döngüleyici ve bir su banyosu kullanarak gerçekleştirin. Termal döngüleyici için, tüpleri reaksiyon bloğuna yerleştirin ve ekipman üzerinde termo profil oluşturun.
Su banyosunu kullanıyorsanız, tüpleri dairesel kaplara güvenli bir şekilde yerleştirin, ardından bu kapları 60 dakika boyunca 66,3 santigrat derecede su banyosuna yerleştirin. Reaksiyon süresinden sonra, tüpleri çıkarın ve kullanana kadar dört santigrat derecede saklayın. Kolorimetrik bir reaksiyon gerçekleştirildiyse, PCR'nin görüntülerini yüksek kaliteli bir kamera ile yakalayın.
Bir sıcaklık gradyanı, optimum erime sıcaklığının 66.3 santigrat derece olduğunu gösterdi. BST 3.0 enziminin konsantrasyonu, mikrolitre başına 3.2 uluslararası birime optimize edildi. Kolorimetrik stratejiyi tanımlamak için, nötr kırmızı boyalardaki fenol kırmızısı değerlendirildi.
Ancak amplifikasyondan sonra herhangi bir renk değişikliği gözlenmedi. Farklı hidroksinaftol mavisi konsantrasyonlarının standardizasyonu, 125 mikromol hidroksinaftol mavisi ile meydana gelen optimum değişiklikle gerçekleştirildi. Amplifiye edilmiş numuneler, konsantrasyonlarına göre renkte bir değişiklik gösterdi.
Numune amplifikasyonu elektroforez ile daha da doğrulandı.
