Başlamak için, ötenazi yapılmış fareyi diseksiyon tahtasına yerleştirin. Diseksiyon T-pimlerini kullanarak, farenin ayak pedlerini tahtaya sabitleyin. Cerrahi diseksiyon makası ile alt karın bölgesini kesin ve çeneye kadar kesin.
Cildi periton astarından ayırdıktan sonra, gövdeden dik olarak gerin ve sabitleyin. Künt forseps kullanarak, servikal, eksenel, brakiyal ve kasık lenf düğümlerini ve dalağı dikkatlice çıkarın ve bunları iki mililitre R9 ortamı içeren 70 mikrometrelik bir hücre süzgecine yerleştirin. Tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için, doku bozma aletini art arda saat yönünde ve saat yönünün tersine yarım tur çevirin.
Süzgeci beş mililitre ortam ile yıkayın. Ardından, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve santrifüjleyin. Süpernatanı boşalttıktan sonra, kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için tüpe 500 mikrolitre lizing tamponu ekleyin.
Bir dakika sonra, hücreleri 9.5 mililitre R9 ortamı ile karıştırın. Tüpü santrifüjleyin. Ve süpernatanı iyice boşaltın.
Daha sonra, hücre peletini anti-MHC2 ve anti-CD4 antikorları içeren 10 mililitre negatif seçim ortamında yeniden süspanse edin ve tüpü 30 dakika boyunca bir külbütöre yerleştirin. Hücreleri beş dakika boyunca 270G'de peletledikten sonra, süpernatanı boşaltın. Aynı anda 15 mililitrelik bir konik tüpte, 200 mikrolitre koyun sıçan önleyici ve immünoglobulin G boncuklarını bir ortamda yedi mililitre yıkayın.
Tüpü bir mıknatısın üzerine yerleştirin ve ortamı çıkarın. İki kez daha yıkadıktan sonra, boncukları yedi mililitre R9 ortamında tekrar süspanse edin. Daha sonra, boncuk süspansiyonunun yedi mililitresini hücre peleti ile karıştırın ve tüpü bir külbütör üzerinde inkübe edin.
Antikor boncuk bağlı hücreleri çıkarmak için, konik tüpü üç dakika boyunca doğrudan mıknatısın üzerine yerleştirin. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik yeni bir tüpe aspire edin ve tüpü mıknatıs üzerinde tutun. Zenginleştirilmiş CD8 pozitif hücreleri peletleyin ve ortamda üç kez yıkayın.
