Tahlil tamponu hazırlamak için kazein, polivinil alkol, polivinilpirolidon ve BSA'yı pH yedi ile karıştırarak başlayın. Daha sonra, numune seyreltme tamponunu yapmak için tahlil tamponunda% 10 tavşan immünoglobulin G hazırlayın. Test için gerekli olan çalışma boncuk karışımının hacmini hazırlayın.
Daha sonra hazırlanan SARS-CoV-2'yi çözün ve süpernatanları bir saat boyunca dört santigrat derecede kontrol edin. SARS-CoV-2 ve kontrol süpernatanları için her biri sekiz adet 1,5 mililitrelik mikrofüj tüpünü etiketleyin ve düzenleyin. Her bir süpernatantın en yüksek seyreltmesini oluşturmak için, 600 mikrolitre süpernatanı uygun şekilde etiketlenmiş tüplerde numune seyreltme tamponu ile birleştirin, ardından karıştırmak için tüpü kısaca girdaplayın.
Sırayla, bir tanesinin 400 mikrolitresini bir sonraki seyreltme tüpüne seyreltilmiş bir süpernata aktarın. Bir sonraki seyreltmeye devam etmeden önce her seyreltilmiş süpernatanı kısaca girdaplayın. Daha sonra, 30 saniye boyunca girdaplamadan sonra önceden hazırlanmış çalışma boncuk karışımını alın ve düz tabanlı, 384 oyuklu bir mikrotitre plakanın atanan her birine beş mikrolitre ekleyin.
Hazırlanan süpernatan seyreltmeden 45 mikrolitreyi, 384 oyuklu plakada mikroküreler içeren atanmış oyuklara ekleyin. Plakayı kapatın ve gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında 650 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Mikrotitre plakasını orbital çalkalayıcıdan çıkardıktan sonra, plakayı 931 g'de bir dakika santrifüjleyin.
Ardından plaka kapatıcıyı çıkarın. Boncukları hareketsiz hale getirmek için, mikrotitre plakasını 30 saniye boyunca bir manyetik plaka ayırıcı üzerine yerleştirin. Mikrotitre plakası hala manyetik ayırıcı üzerinde konumdayken, süpernatanı mıknatısla hareketsiz hale getirilmiş boncuklardan aspire edin.
Mikrotitre plakasını manyetik ayırıcıdan çıkardıktan sonra, boncuk içeren her bir oyuğa 60 mikrolitre PBST ekleyin. Daha sonra, farklı algılama karışımları hazırlamak için beş adet 1,5 mililitrelik tüp alın. Her tüpe insan monoklonal anti-S1 antikoru ve SARS-CoV-2 partikülündeki spike proteinini hedefleyen FLAG etiketli, tek zincirli değişken fragmanlar ekleyin.
Yıkanmış mikrokürelere uygun tek zincirli, değişken parçaya özgü, sivri uç algılama karışımının kuyu başına 50 mikrolitre ekleyin. Mikrotitre plakasını kapatın ve daha önce gösterildiği gibi inkübe edin. Ardından mikrotitre plakasını santrifüjleyin.
Boncuklardaki fazla sivri uç algılama reaktifini 60 mikrolitre PBST ile üç kez yıkayın. Daha sonra, 21 konjuge anti-FLAG antikoru için PE konjuge, anti-insan immünoglobulin G ve parlak menekşe içeren bir floresan çözeltisi hazırlayın. Yıkanmış mikrokürelere floresan çözelti karışımı başına 50 mikrolitre ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi inkübe edin.
Ardından mikrotitre plakasını aşağı doğru döndürün. Fazla floresan çözelti karışımını mikro kürelerden 60 mikrolitre PBST ile yıkayın. Mikroküreleri son yıkama adımından itibaren 60 mikrolitre PBST'de askıya alın.
Ardından, plakayı istenen ayarlarla çift raporlayıcılı bir akış analiz sisteminde analiz edin. SARS-CoV-2 ile enfekte hücre süpernatantlarının her iki raportör kanalda seyreltilmesinde, konsantrasyona bağlı bir sinyal gözlendi. Beş tek zincirli değişken fragmandan üçü, virüsü bir ila 18 kadar düşük seyreltmede tespit edebilir.
Kalan iki tek zincirli değişken fragman için virüs, bir ila altı kadar düşük seyreltmelerde tespit edilebilir.
