Başlamak için, pistonu 50 mililitrelik bir şırıngadan çıkarın ve şırınga ucuna düşük protein bağlayıcı bir polietersülfon veya bir poliviniliden florür 0.45 mikrometre steril filtre yerleştirin. 25 mililitrelik bir serolojik Stripette kullanarak, hücre süspansiyonu HEK293T transfekte edilmiş lentivirüsü şırıngaya ekleyin ve pistonu yavaşça geri koyun. Pistonu yavaşça itin ve süzüntüyü 50 mililitrelik yeni bir tüpte toplayın.
Tamamlandığında, filtreyi şırıngadan çıkarın ve dekontaminasyon solüsyonuna atın. Ultrasantrifüj tüpünün dibine üç mililitre% 20'lik bir sükroz çözeltisi ekleyin. Ardından, PIPETBOY'u en düşük hıza ayarlayın.
Ultrasantrifüj tüpünü yaklaşık 45 derecelik açıyla tutun ve filtrelenmiş lentivirüs içeren ortamı yavaşça tüp duvarına ekleyin. Katmanların tüpten net bir şekilde ayrıldığını gözlemleyin. Toplam tüp hacmi 29 mililitreden azsa, sıkma sırasında tüpün çökmesini önlemek için taze cDMEM ekleyin.
Ultrasantrifüj kovasını %70 alkolle silin ve tüp adaptörünü kovanın dibine koyun. Ardından, ultrasantrifüj tüpünü kovaya yerleştirin. Kovayı kapatın ve rafa yerleştirin.
Ultrasantrifüjü dört santigrat dereceye kadar önceden soğutun. Kovayı dikkatlice rotora yerleştirin ve vakumu açın. Hızlanma ve yavaşlama oranını en düşük ayara ayarlayın ve dört santigrat derecede 90 dakika boyunca 26.000 RPM'de santrifüjleyin.
Santrifüjlemeden sonra vakumu kapatın ve numuneleri rahatsız etmeden rotoru dikkatlice çıkarın. Kovalardan herhangi bir dökülme ve sızıntı olmadığını doğrulamak için ultrasantrifüjü gözlemleyin. Bir ultrasantrifüj tüpünün içeriğini tek bir yumuşak hareketle atık kabına dökün.
Tüpü 10 dakika boyunca çift katmanlı bir kağıt mendil üzerine ters çevirin. Bu arada, kovanın içini %70 etanole batırılmış kağıt mendille silin ve baş aşağı havayla kurutun. Kağıt mendil kullanarak, ultrasantrifüj tüpünün kenarından kalan sıvıyı dikkatlice kurulayın.
Peleti bir mililitre uygun serumsuz ortamda tekrar süspanse edin ve 15 dakika bekletin. Bir mililitrelik bir pipet kullanarak, lentivirüs preparatlarını nazikçe karıştırın ve bunları 1.5 mililitrelik vidalı tüplere ayırın. Lentiviral preparatları eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Başarılı lentivirüs preparatı, beş mikrolitrelik bir dozla% 95'in üzerinde bir enfeksiyon oranı elde etti. Enfekte hücrelerin ortalama floresan yoğunluğu daha yüksek dozlarla artar. 100 mikrolitre lentivirüs preparatının intraperitoneal enjeksiyonu, farelerin periton hücrelerinde GFP sinyalinin en yüksek yüzdesini ve yoğunluğunu verdi.
100 mikrolitrelik lentivirüs enjeksiyonu ile yapılan zaman seyri deneyleri, üçüncü ve yedinci günlerde GFP eksprese eden yerleşik hücrelerin önemli bir yüzdesini ortaya çıkardı ve bunu 14. günde enfekte olmuş popülasyonun ortadan kalkması izledi.
