HEK 293 T hücrelerini transfekte ederek başlayın. Transfeksiyondan üç gün sonra, ortamı kuyulardan çıkarın ve bir kez PBS ile yıkayın. Her kuyucuğa 500 mikrolitre tripsin ekleyin.
Tüm hücreleri plakadan ayırmak için 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Daha sonra her bir oyuğa 500 mikrolitre tam DMEM ortamı ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse edin. Tüm hücreleri her bir kuyucuktan 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın.
Daha sonra oda sıcaklığında 1.000 g'da iki dakika santrifüjleyin. Süpernatanı pipetleyerek dikkatlice çıkarın ve peleti bir mililitre PBS ile bir kez yıkayın. Yine, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücreleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin.
Hücreleri FACS tüplerine aktarın. Bir akış sitometresi kullanarak hücreleri test edin. Rezeke edilmemiş hücre süspansiyonunu yükleyin.
Akış sitometrisi çalışma sayfasında, ileri ve yan saçılma voltajlarını al'a basın ve ayarlayın. Hücreleri orta bölgeye yerleştirmek için, sol alt kadrandaki kalıntıları dışlamak için bu popülasyon R1'in etrafını dolaşın. FL1, FL2 nokta lekesinin kapısını G R1 olarak değiştirin. Dörtlü geçit aracını seçin ve FL1/FL2 nokta lekesindeki hücre popülasyonunun sağ üst ucuna G R1 olarak tıklayın. Hücreleri sol alt kadranda konumlandırmak için FL1/FL2 voltajlarını ayarlayın.
Duraklat ve İptal'e basın. Ardından GFP tek renkli kontrol hücrelerini yükleyin. GFP pozitif hücrelerini sağ alt kadranda konumlandırmak için Al'a basın ve telafiyi ayarlayın.
Duraklat ve İptal'e basın. Ardından, mCherry tek renkli kontrol hücrelerini yükleyin. mCherry pozitif hücrelerini sol üst kadranda konumlandırmak için Al'a basın ve telafiyi ayarlayın.
Duraklat ve İptal'e basın. Menü çubuğunda Edin'e tıklayın ve Edinme Depolama Alanı'nı seçin. Toplama ölçütleri altında, 10.000 adet G1 R1 olayı sayıldığında Alım durdurulacak seçeneğini belirleyin.
Kurulum onay işaretini iptal edin. Örnek hücreleri yükleyin. Al'a basın ve 10.000 G1 R1 hücresi sayılana kadar bekleyin.
Diğer numuneler ve kontroller için de aynısını tekrarlayın.
