Başlamak için tüm faks dosyalarını analiz panosuna aktarın. İleri dağılım tarafı dağılım grafiğini görüntülemek için dosyalardan birini açın. Sağlam hücreleri izole etmek için bir çokgen kapısı oluşturun ve arsanın sol alt köşesindeki kalıntıları önleyin.
Alt popülasyonu bozulmamış hücreler olarak etiketleyin ve bu geçidi tüm örnekler çubuğuna sürükleyin. Sonraki örnek düğmesini kullanarak her örnek için geçişi doğrulayın. Yeni bir çizim oluşturmak için negatif kontrol örneğinin bozulmamış hücreler alt popülasyonuna çift tıklayın.
GFP'yi temsil etmek için çizim eksenini X ekseninde FL1-H ve mCherry'yi temsil eden Y ekseninde FL2-H olarak ayarlayın. Ardından, dörtlü geçit aracını seçin ve negatif hücre popülasyonunun sağ üst ucuna tıklayın. Dört dikdörtgen kapıyı sağlam hücreler çubuğuna sürükleyin.
Sonraki numune düğmesini kullanarak doğru geçit için her bir GFP veya mCherry tek renk kontrolü örneğini inceleyin. Düzen düzenleyicisine gidin. Burada, temsili çizimleri seçin ve düzen düzenleyicisine kopyala'yı seçin.
Tüm temsili çizimleri seçin, ardından grafik tanımını açmak için çift tıklayın. X ekseni etiketini GFP ve Y ekseni etiketini mCherry olarak adlandırın. Aynı arsa içindeki GFP pozitif hücrelerin sayısını mCherry pozitif hücrelerin sayısıyla karşılaştırarak bağıl DNA onarım verimliliğini belirleyin.
NHEJ ve HR analizinin doğruluğunu sağlamak için uygun bir kompanzasyon ayarlaması ve geçit stratejisi uygulandı. Bu strateji, GFP pozitif hücreleri sağ alt kadranda ve mCherry pozitif hücreleri sol üst kadranda konumlandırdı. GFP pozitif hücrelerin yüzdesi DNA DSB onarımı ve transfeksiyon verimliliğini gösterdi.
Tersine, mCherry pozitif hücrelerin yüzdesi sadece transfeksiyon verimliliğini yansıtıyordu. DNA DSB onarım etkinliği, GFP pozitifin mCherry pozitif hücrelere oranı olarak hesaplandı. Ek olarak, Wiskott-Aldrich sendromu proteininin ve SCAR Humalog veya WASH proteininin DNA onarımındaki rolü, shCONTROL ve shWASH hücreleri üzerinde NHEJ testi kullanılarak gösterilmiştir.
WASH kaybı, NHEJ verimliliğini azalttı ve NHEJ'yi teşvik etmedeki rolünün altını çizdi.
