Başlamak için, önceden ısıtılmış enzimatik hücre sindirim reaktifi içeren 15 mililitrelik tüpü, kullanılana kadar 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. 500 mikrolitre taze hazırlanmış PBS / EDTA'yı 24 oyuklu bir plakanın kuyularına alıkoyun. Parlak alan mikroskobu altında, farklılaşmış üç boyutlu insan bağırsak organoidlerinin ve transwelllerinin büyümesini gözlemleyin.
Hücre kültürü eklerini büyüme ortamından PBS/EDTA çözeltisine aktarın. Kültür ortamını apikal taraftan çıkarın ve hücre tabakasını bozmadan 100 mikrolitre PBS / EDTA ile değiştirin. PBS/EDTA'yı attıktan sonra, eki kuyudan çıkarın, bir kağıt havlunun kenarına nazikçe kurulayın ve tezgah üstüne ters çevirin.
Keskin bir neşter bıçağı kullanarak, zarı ek parçadan çıkarmak için zarın iç çevresini kesin. Membranı forseps ile 200 mikrolitre önceden ısıtılmış enzimatik hücre sindirim reaktifi içeren 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Membranı bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca yerleştirin.
Her 10 dakikada bir, bir P 200 pipeti kullanarak tüm hacmi beş kez pipetleyin. Tek hücrelerin yüzdesini kalitatif olarak değerlendirerek ayrışmayı değerlendirmek için her 10 dakikada bir ila iki mikrolitre hücre süspansiyonunu bir cam slayta aktarın. Ayrışmadan sonra, tek bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünde koşul başına üç kopya kuyusunu birleştirin.
10 mikromolar ROCK inhibitörü içeren 400 mikrolitre hücre kültürü farklılaştırma ortamı ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın. Tüm hacmi 70 mikronluk bir süzgeçten geçirin ve akışı 1,5 mililitrelik yeni bir tüpte toplayın. Daha sonra 70 mikronluk bir süzgeçten elde edilen akışı 40 mikronluk uçlu bir süzgeçte süzün.
Beş mikrolitre hücre süspansiyonuna beş mikrolitre% 0.4 tripan mavisi ekleyin ve canlı tek hücreleri sayın. Mikrolitre başına 1.000 hücre elde etmek için numuneyi WRNE büyüme ortamı ile seyreltin. Membran hücre kültürü eklerinde büyütülen farklılaşmış jejunal insan bağırsak organoidlerinden toplam 5.623 tek hücre izole edildi.
