Başlamak için, insan bağırsak organoidlerinin sindirimi için enzimatik hücre sindirim reaktifi ve PBS / EDTA hazırlayın. Parlak alan mikroskobu altında, farklılaşmış üç boyutlu insan bağırsak organoidlerinin tek tabakalar olarak büyümesini onaylayın. Hücre kültürü ortamını tek katmanlı kültürden atın ve 100 mikrolitre PBS / EDTA ile değiştirin.
PBS / EDTA'yı çıkardıktan sonra, her oyuğa 100 mikrolitre ılık enzimatik hücre sindirim reaktifi ekleyin. Plakayı %5 karbondioksit inkübatöre 37 santigrat dereceye getirin ve tüm hacmi 20 ila 30 dakika boyunca her 10 dakikada bir beş kez pipetleyin. Tek hücrelerin yüzdesini gözlemleyerek ayrışmayı değerlendirmek için her 10 dakikada bir ila iki mikrolitre hücre süspansiyonunu bir cam slayta aktarın.
Ayrışmadan sonra, tek bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde koşul başına üç çoğaltma kuyusunu birleştirin. 10 mikromolar ROCK inhibitörü içeren 700 mikrolitre hücre kültürü farklılaştırma ortamı ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın. Tüm hacmi 70 mikron uçlu bir süzgeçten geçirin ve akışı 1,5 mililitrelik yeni bir tüpte toplayın.
70 mikronluk bir süzgeçten elde edilen akışı 40 mikronluk uçlu bir süzgeçte süzün. Beş mikrolitre hücre süspansiyonuna beş mikrolitre% 0.4 Tripan Mavisi ekleyin ve canlı tek hücreleri sayın. Mikrolitre başına 1.000 hücre elde etmek için numuneyi ROCK inhibitörü içeren hücre kültürü ortamı ile seyreltin.
96 oyuklu plakada büyütülen farklılaşmış bağırsak insan bağırsak organoidlerinden toplam 9.952 tek hücre izole edildi.
