Başlamak için, farklılaşmış THP-1 hücreleri elde edin ve harcanan ortamı kültür plakasının kuyularından çıkarın Hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, hücrelere lipopolisakkarit veya LPS içeren serum içermeyen ortam ekleyin ve plakayı inkübe edin. Daha sonra model grubuna adenozin trifosfat veya ATP stok çözeltisini ekleyin ve plakayı %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin. Daha sonra, tüm süpernatanı kültür plakasının kuyularından aspire edin.
Hücreleri PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, her bir oyuğa 500 mikrolitre% 0.05 tripsin ekleyin ve 30 saniye inkübe edin. Hücre ayrılmasını durdurmak için bir mililitre RPMI 1640 ortamı ekleyin ve hücreleri beş mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin.
Hücreleri bir mililitre PBS'de yeniden süspanse ettikten sonra, hücrelerin bulunduğu tüpü üç dakika boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin ve santrifüjleyin. Hücreleri yeniden süspanse etmek için 100 mikrolitre 1X bağlayıcı tampon ekleyin ve hücreleri beş mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Kontrol ve model tüplerini karanlıkta oda sıcaklığında uygun reaktiflerle inkübe edin.
Kuluçkayı sonlandırmak için, tüpe 400 mikrolitre PBS ekleyin ve hafifçe girdaplayın. Hücre süspansiyonunu, beş mililitrelik, polistiren, yuvarlak tabanlı bir tüpe sabitlenmiş 35 mikrometrelik bir naylon ağda filtreleyin. Temiz bir kapak camını iki saat krom şap çözeltisine batırın ve 37 derecelik bir fırında kurutun.
Tripsinizlenmiş hücreleri daha önce gösterildiği gibi pelet haline getirin ve hücreleri oda sıcaklığında iki saat boyunca 500 mikrolitre elektron mikroskobu fiksatörü ile sabitleyin, ardından dört santigrat derecede gece boyunca inkübasyon yapın. Hücreleri sabit çözeltiden topladıktan sonra, oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300 G'de pelet haline getirin. 100 mikrolitre PBS ekleyin ve hücreleri yavaşça üfleyin.
Hücre süspansiyonunu bir kapak camına bırakın ve beş dakika bekletin. Tüm süpernatanı aspire edin ve hücreleri her biri beş dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. 500 mikrolitre% 1 osmik asit fiksasyon çözeltisi ekleyin.
Bir saat sonra, tüm süpernatanı aspire edin. Üç PBS yıkamasından sonra, numuneleri artan etanol konsantrasyonlarında kurutun. Kritik nokta kurutucuyu açın, karbondioksit tankını açın ve hazneyi 10 santigrat dereceye kadar soğutun.
Numuneyi hızlı bir şekilde filtre kağıdı ile sarın ve hazne basıncı inç kare başına sıfır pound olduğunda hazneye koyun. Sıcaklık 35 santigrat dereceye sabitlendiğinde ve basınç inç kare başına 1.250 pound'a ulaştığında, dakikada inç kare başına 100 pound'da basınçsızlaştırın. Hazne basıncı sıfır olduğunda numuneyi çıkarın.
Son olarak, iletken bant kullanarak, numuneleri taramalı elektron mikroskobuna, bir püskürtme kodlayıcı kullanan alüminyum numune tutuculara monte edin. Numuneleri iki ila beş nanometrelik bir altın tabakasıyla kaplayın. Akış sitometrisi analizi, LPS / ATP stimülasyonundan sonra, QT bölgesindeki hücrelerin hücre ölümünü gösteren önemli ölçüde arttığını gösterdi.
Plazma zarı yüzeyinin taramalı elektron mikrografları, kontrol hücreleri normal görünürken, LPS / ATP ile uyarılan hücrelerde zar kanaması ve yırtılması dahil olmak üzere piroptozun özelliklerini gösterdi. Ek olarak, LPS/ATP stimülasyonu hücrelerde membran kanaması ve hücre küçülmesi gibi apoptotik özelliklerin ortaya çıkmasına neden olmuş ve hücre şişmesi ve membran rüptürasyonu gibi nekrotoz özelliklerine sahip hücreler gözlenmiştir.
