Başlamak için, ötenazi yapılan sıçanın mezenterik lenf damarlarını izole edin ve kanüle edin. Füzyon odasındaki lenf damarlarına basınç uygulayın ve dengelenmelerine ve stabil spontan kasılmalar geliştirmelerine izin verin. Daha sonra lenf damarlarını Fura-2-asetoksimetil ester ve pluronik asit ile karanlıkta 30 dakika inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, tüm banyo hacmini negatif basınçlı bir vakumla boşaltın ve sıcaklığa uygun, reaktif içermeyen fizyolojik tuz çözeltisi ile üç kez yeniden doldurun. Ardından, fazla indikatörü çıkarmak ve deesterifikasyona izin vermek için lenf damarlarını 15 dakika daha karanlıkta inkübe edin. Odayı, 15 hertz floresan yakalama için LED ışıklı, 20XS flor objektifli, kendinden çerçeveli adaptörlü ve kameralı ters çevrilmiş bir floresan mikroskobuna aktarın.
Floresan kaydetmek ve kenar algılaması yapmak için mikroskobu görüntüleme yazılımıyla donatılmış bir bilgisayara bağlayın. LED ışık kaynağını ve floresan sistem arayüzünü etkinleştirin. Şimdi IonWizard yazılımını başlatın.
Dosya sekmesi altında, Yeni seçeneğini belirleyin. Ardından Topla sekmesine gidin ve Deneme'yi seçin. İstediğiniz deneysel şablonu yükleyin ve Tamam'ı tıklatın. Denemeyi başlatmak için ekranın alt kısmında bulunan Başlat düğmesine tıklayın.
Ardından, damar çapını, payı, 340 sinyalini, paydasını, 380 sinyalini ve oranını azalan sırada görüntülemek için ekrandaki izleri ayarlayın. Daha iyi izleme görselleştirmesi için Y ekseni ölçeğini değiştirmek üzere İzlemeler'e gidin, Otomatik Sınırlar'ın işaretli olmadığından emin olun ve Kullanıcı Sınırlarını Düzenle'yi seçin. Ayarlanacak parametreyi seçin, eksen için minimum ve maksimum değerleri girin ve ardından onaylamak için Tamam'ı seçin.
Kenar algılama yazılımını kullanarak, aydınlatmayı lenf damarı duvarı koyu çizgiler olarak görünecek şekilde ayarlayın. Yağ ve kalıntı içermeyen bir ilgi alanı veya yatırım getirisi seçin ve bu yatırım getirisini hareket ettirmediğinizden emin olun. Eşiği, damar duvarı kenarı tüm kasılma döngüsü boyunca algılanacak şekilde ayarlayın.
Fotoğraf çarpan tüpünü etkinleştirdikten sonra, LED aydınlatıcıları kullanarak Fura-2'yi uyarmak için 340 ve 380 nanometre dalga boylarını ve 50 milisaniye pozlamaları değiştirin. Tüm görüntüleme alanı boyunca 510 nanometre ve 15 hertz'de emisyon spektrumlarını yakalayın. Sinyal-arka plan oranını ölçmek için, önce lenf damarı görüş alanının merkezindeyken 340 ve 380 floresan elde edin.
Ardından, arka planı yakalamak için görüş alanını, herhangi bir kap olmadan banyonun kenarına taşıyın. Daha sonra, fazla Fura-2 indikatörünü çıkarmak için banyo solüsyonunu sıcaklığa uygun, reaktif içermeyen bir fizyolojik tuz solüsyonu ile değiştirin. Başlangıç Fura-2 floresan sinyalini ve spontan kasılmaları yaklaşık 30 dakika boyunca kaydedin.
Daha sonra Nifedipin'in kümülatif konsantrasyon tepkisini kaydedin ve her ilaç konsantrasyonu için arka plan ölçümleri elde edin. Her deneyin sonunda, kalsiyum iyonlarının yokluğunda minimum Fura-2 floresan sinyalini ve lenf damarlarının maksimum çapını elde etmek için lenf damarlarını sıcaklığa uygun, kalsiyum içermeyen fizyolojik tuz çözeltisi ile yıkayın. Doymuş kalsiyum iyonları koşullarında maksimum Fura-2 floresan sinyalini ve lenf damarlarının minimum çapını elde etmek için banyo solüsyonunu 10 milimolar kalsiyum iyonu ve iyonomisin içeren sıcaklığa uygun bir fizyolojik tuz solüsyonu ile değiştirin.
Kalsiyum spike amplitüdü, bazal kalsiyum ve pik kalsiyum dahil olmak üzere parametreler, perfüzyon odasına artımlı nifedipin ilavesi ile konsantrasyona bağlı bir azalma sergiledi. Aynı zamanda, kasılma, genlik ve hesaplanan akış gibi kasılma parametreleri de kademeli bir azalma gösterdi. Manhattan grafikleri, aralık, kasılma süresi ve gevşeme süresi dahil olmak üzere ritmik ölçümler için bireysel lenf damarı tepkilerini gösterdi.
