Domuz adacık saflaştırması için sürekli gradyan yöntemi

Başlamak için, bir pompayı dakikada 200 mililitre akış hızına ayarlayın ve 125 mililitre yüksek yoğunluklu gradyan çözeltisini sürekli gradyan oluşturucuya ve ardından hücre işlemcisine yükleyin. Hücre işlemcisi santrifüj işlevini 1.000 RPM'de başlatın. Sistemdeki havayı boşaltın ve yüksek yoğunluklu gradyan solüsyonu ile yeniden üretin.

Daha sonra gradyan oluşturucuya 125 mililitre yüksek yoğunluklu gradyan çözeltisi ve 130 mililitre düşük yoğunluklu çözelti ekleyin. 100 mililitre sindirilmiş doku süspansiyonu yükleyin. Hücre işlemci hızını üç dakika boyunca 2.000 RPM'ye yükseltin.

Saflaştırılmış adacık fraksiyonunu toplamak için 16 50 mililitrelik konik tüp hazırlamak için, her tüpe 25 mililitre RPMI ortamı ekleyin ve bunları artan sırada düzenleyin. Saflaştırılmış adacık fraksiyonlarını hazırlanan konik tüplerde toplayın. Adacıkları boyamak için, her saflaştırılmış adacık fraksiyonundan 100 ila 200 mikrolitre alikot toplayın ve 24 oyuklu bir doku kültürü plakasında DTZ boyamayı kullanarak adacık içeriğini değerlendirin.

Her bir fraksiyonu, adacıkların koyu kırmızıdan siyaha görüneceği 4X'te ışık mikroskobu kullanarak inceleyin. Bu protokol kullanılarak, üç domuz üzerinde pankreas adacık izolasyonu yapıldı. Brightfield görüntüleri, canlı/ölü boyama kullanılarak canlılık açısından karakterize edilen saflaştırılmış pankreas adacıklarını gösterdi.

Adacık izolasyonundan sonra temsili adacık boyutu dağılımı 50 ila 100 mikron arasında boyut dağılımı göstermiştir. Ayrıca, verim ve saflık, verimli domuz pankreas izolasyonlarını gösteren bir adacık hücresi sayacı kullanılarak değerlendirildi.