Başlamak için, sıvı nitrojenden üçüncü geçişte donmuş insan yağ kaynaklı mezenkimal kök hücreleri içeren iki kriyoprezervasyon tüpü alın. Tamamen çözülene kadar 37 santigrat derecelik bir su banyosunda çalkalayın. Daha sonra tüpleri% 75 alkol kullanarak dezenfekte edin.
Dezenfekte edilmiş tüpleri ultra temiz bir masaya yerleştirin. Bir pipet kullanarak hücre süspansiyonunu aspire edin ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü düşük hızlı bir santrifüjde 250 G ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüjleyin.
Bu arada, dört adet 10 santimetrelik kültür kabı hazırlayın ve her yemeğe dokuz mililitre orta ekleyin. Her yemeğin adını, hücre türünü, neslini ve deney tarihini işaretleyin. Daha sonra bunları 37 santigrat derece termostatik hücreli inkübatörde önceden ısıtın.
Beş dakikalık santrifüjleme bittiğinde, santrifüj tüpünü ultra temiz bir masaya taşımadan önce dezenfekte edin. Bir pipet kullanarak, süpernatanı çıkarın ve istenen hücre konsantrasyonunu elde etmek için dört mililitre ortam ekleyin. Çözeltiyi eşit şekilde dağılana kadar yavaşça çalkalayın.
Daha sonra, önceden ısıtılmış her bir tabağa bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin ve aynı şekilde düz bir yüzeyde çapraz düzende çalkalayarak çalkalayın. Bulaşıkları 37 derecelik inkübatöre yerleştirmeden önce optik mikroskop altında hücreleri 40x büyütmede gözlemleyin. İkinci günde, değişim ortamı hazırlığına devam etmeden önce optik mikroskop altında 40x büyütmede hücre durumunu gözlemleyin.
Dezenfeksiyondan sonra, kültür kaplarını Biyogüvenlik Seviyesi 2 olan ultra temiz bir masaya aktarın. Ortamı her kültür kabından çıkarın. Çanağı iki mililitre PBS solüsyonu ile iki kez nazikçe durulayın ve her yemeğe 10 mililitre orta ekleyin.
Hücreleri, süpernatan toplamaya hazır olana kadar inkübatöre aktarın.
