Başlamak için, bir çalışma platformuna bir diseksiyon mikroskobu, ince uçlu iki forseps, makas, bir mililitrelik şırınga iğnesi ve filtre kağıdı monte edin. Daha sonra, dirsek makası kullanarak, anestezi uygulanmış bir farenin gözlerini çekirdeklendirin. Gözleri 0,1 molar fosfat tamponunda %4 paraformaldehit ve %0,2 pikrik asit içeren bir cam kaba yerleştirin.
Diseksiyon mikroskobunda, bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, kornea limpusuna bir delik açın ve ön segmenti makasla kesin. Lensi iç retina yüzeyinden çıkarmak için forseps kullanın. Şimdi iki forseps kullanarak, retina göz kabından tamamen izole olana kadar sklerayı dikkatlice soyun.
Daha sonra, retinayı dört parçaya bölün. Gece boyunca fiksasyon ve% 4 paraformaldehit çözeltisinden sonra, retina dokularını 0.01 molar PBS'de her biri 10 dakika boyunca altı kez yıkayın. Retina dokusunu 0.01 molar PBS'de% 1 sodyum borhidrür içinde 30 dakika inkübe edin.
Yine, retina bölümlerini 0.01 molar PBS'de en az altı kez yıkayın. Ardından vitreusu filtre kağıdı ile çıkarın. Ve iki ucu keskin bir tıraş bıçağı kullanarak retinayı 100 ila 300 mikrometre arasında küçük bölümlere ayırın.
Retina şeritlerini 0.01 molar PBS'de altı kez, her biri 10 dakika boyunca yıkayın ve iki gün boyunca ABC kitinden Reaktif A ve Reaktif B ile inkübe edin. Daha sonra, retina şeritlerini 0.05 molar tris tamponunda her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Retina şeritlerini diaminobenzen veya DAB kitinden %5 Reaktif 1 ve %5 Reaktif 3 ile oda sıcaklığında bir saat damıtılmış suda önceden inkübe edin.
Retina şeritlerini DAB ile boyamak için, DAB kitindeki üç tüpten sırayla aynı hacimde çözelti ekleyin. Diseksiyon mikroskobu altında lekelenme durumunu gözlemleyin. Retina şeritlerini 0.05 molar tris tamponu ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
Son olarak, şeritleri 0.01 molar PBS'de her biri 10 dakika boyunca altı kez yıkayın. Kontrol deneylerinde, iki şeritli koni pedikülleri ve bir şeritli küresel çubuk pediküller, birincil antikorların yokluğunda immünoreaktivite göstermedi. Protein kinaz C alfa, retinadaki çubuk bipolar hücreleri tanımladı.
DAB duruşu, dış pleksiform tabakada çubuk ve koni terminalleri ile sinapslar oluşturan protein kinaz C alfa ve bipolar hücre dendritlerinin varlığını sergiler. Ek olarak, DAB reaksiyon ürünü, iç pleksiform tabakadaki çubuk bipolar hücre terminallerinin ve aksonal süreçlerin tanımlanmasına yardımcı olur. P immunreaktivitesi amakrin hücrelerinin, P negatif amakrin hücrelerine karşı presinaptik olduğu gösterilmiştir.
Ayrıca, P immünoreaktivitesi amakrin hücreleri, iç pleksiform tabakanın sırasıyla üçüncü ve beşinci alt tabaka seviyelerinde post-sinaptik ila bipolar terminallerdi.
