Başlamak için, beş mililitrelik bir polipropilen tüpe 70 mikrometrelik bir süzgeç yerleştirin. Üzerine 500 mikrolitre nöral hücre ortamı pipetleyin. Ayrışmış fare hipokampus dokusu homojenatını süzgeçten geçerek tüpe aktarın.
Daha sonra durulamak için homojenizatörün üzerine bir mililitre soğuk nöral hücre besiyerini iki kez pipetleyin. Şimdi, yeniden süspanse etmek için pelete 500 mikrolitre buz gibi soğuk DPBS ekleyin. DPBS ile süspansiyonun hacmini 1,5 mililitreye yükseltin.
Numuneye 500 mikrolitre izotonik percoll solüsyonu pipetleyin. Çözeltiyi santrifüjde iki mililitre soğuk DPBS ile kaplayın. Daha sonra üst tabakayı ve orta fazdaki miyelin diskini aspire edin.
Daha sonra, tüpe dört mililitre soğuk DPBS ekleyin, süpernatanı santrifüjledikten sonra aspire edin. Daha sonra hücreleri 100 mikrolitre sabitlenebilir canlılık boyama solüsyonunda yeniden süspanse edin. Numuneyi beş dakika boyunca 300 x g'da santrifüjlemeden önce numuneye bir mililitre soğuk DPBS pipetleyin.
Süpernatanı aspire ettikten sonra, 100 mikrolitre CD16, CD32 boyama çözeltisi ekleyin. Numuneyi beş saniye boyunca girdaplayın, ardından inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneye ve santrifüje bir mililitre FACS tamponu ekleyin.
100 mikrolitre boyama ana karışımını tüpe pipetleyin. Daha sonra numuneleri karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Şimdi, daha önce olduğu gibi santrifüjlemeden önce numuneye bir mililitre FACS tamponu ekleyin.
Süpernatanı attıktan sonra peleti 250 mikrolitre fiksasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, tüpe iki mililitre geçirgenlik tamponu ekleyin ve tekrar santrifüjleyin. Peletin üzerine 100 mikrolitre vGLUT1 boyama solüsyonu pipetleyin.
Daha sonra inkübasyon ve santrifüjlemeden önce karışımı yaklaşık beş saniye vorteksleyin. Hücre peletini 250 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Son olarak, numuneleri 40 mikrometrelik bir filtreden süzün.
İzotip kontrolüne kıyasla hipokampal mikrogliadan daha yüksek bir vGLUT1-PE floresan sinyali gözlendi. Koku soğancığından gelen mikrogliada daha yüksek bir vGLUT1-PE floresan sinyali ve beyincikte hipokampusa kıyasla daha düşük bir sinyal bulundu. En düşük sinyal yoğunluğu dalak makrofajlarında tespit edildi.
