Başlamak için, ayrışmış fare hipokampal dokusu içeren bir tüpü 37 santigrat derecede bir su banyosunda 20 dakika boyunca inkübe edin. Bulanık hücre süspansiyonunu yeni bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini beş mililitre yıkama karışımı çözeltisinde yeniden süspanse edin.
Daha sonra, tekrar santrifüjlemeden önce numuneyi 70 mikrometrelik bir filtreden beş mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne geçirin. Numuneyi Percoll gradyan santrifüjüne tabi tutun, ardından hücre peletini 100 mikrolitre MACS boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve inkübe edin. Şimdi, santrifüjlemeden önce numuneye bir mililitre MACS tamponu pipetleyin.
Ardından, hücre peletini 500 mikrolitre MACS tamponunda askıya alın. Ardından, manyetik bir ayırıcının pozitif seçim sütunlarını üç mililitre MACS tamponu ile durulayın. 500 mikrolitre hücre süspansiyonunu bir sütuna nazikçe uygulayın.
Kolonları MACS tamponu ile üç kez yıkadıktan sonra 15 mililitrelik konik tüplere yerleştirin. Sütuna beş mililitre MACS arabelleği ekleyin. Ardından, numuneleri 300 g'da 10 dakika santrifüjleyin, ardından pelete bir mililitre önceden ısıtılmış DMEM ekleyin.
Son hücre süspansiyonunun 500 mikrolitresini 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Her kuyucuğun 250 mikrolitresini önceden ısıtılmış taze DMEM ile değiştirin. Ardından, ortamın üzerine üç mikrogram pHrodo Red etiketli sinaptozom ekleyin.
Negatif denetimlere aynı hacimde etiketlenmemiş sinaptozom ekleyin. Kuluçkadan sonra, kuyuları soğuk DPBS ile yıkayın. Şimdi, her bir oyuğa 200 mikrolitre tripsin-EDTA pipetleyin.
35 saniyelik bir inkübasyondan sonra, her bir oyuğa bir mililitre FBS içeren DPBS pipetleyin. Hücre süspansiyonunu bir süzgeçten geçirerek beş mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın, ardından her bir kuyucuğu 500 mikrolitre buz gibi DPBS ile iki kez yıkayın. Santrifüj, beş dakika boyunca 500 g'da numune topladı.
Bunu takiben, hücreleri 100 mikrolitre boyama çözeltisinde buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, 1 ila 100 arasında bir son konsantrasyon elde etmek için boyama çözeltisine CD11b ve CD45 ekleyin. Numuneleri karanlıkta 20 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Numuneye bir mililitre FACS tamponu pipetleyin, ardından akış sitometrik analizinden önce 10 dakika boyunca 300 g'da son bir santrifüjlemeye tabi tutun. CD11b-pozitif ve CD45-pozitif mikroglia'da pH 4'te sinaptozomlardan elde edilenle karşılaştırılabilir pozitif bir PE floresansı gözlendi.
