Başlamak için, sisplatin, metal konjuge antikorlar ve interkalatör-iridyum çözeltisi ile boyanmış iskelet kası hücrelerini alın ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatant çıkarıldıktan sonra, girdaplı hücrelere bir mililitre CSM ekleyin. Hücreleri santrifüjleme ile pelet haline getirin ve bir mililitre CAS tamponunda yıkayın.
Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı yaklaşık 200 mikrolitreye aspire edin. Girdaplı numunelere bir mililitre CAS tamponu ekleyin ve hücre sayımı için beş mikrolitre alikot edin. Hücreleri santrifüjledikten ve süpernatanı 50 mikrolitreye aspire ettikten sonra, hücreleri CAS tamponunda mililitre başına 1 milyon hücrelik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin ve 0.1x'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için kalibrasyon boncukları ekleyin.
Saniyede 400 ila 500 hücrelik bir akış hızı kullanarak veri toplamak için numuneyi kütle sitometresine yükleyin ve topladıktan sonra verileri normalleştirin. Gerekirse, her örnek için ayrı Akış Sitometri Standardı veya FCS dosyalarını tek bir dosyada birleştirin. İridyum interkalatör pozitif olaylarına geçit yaparak tek hücreleri tanımlayın.
Cisplatin'in canlı hücreler için geçit oluşturması için negatif olan olayları seçin. İlgilenilen popülasyonu belirleyin ve kök ve progenitör hücrelerin nispi oranını ölçün. Yüksek boyutlu analiz yapmak için, ilgilenilen popülasyonu dışa aktarın ve kümeleme algoritmalarını kullanın.
X kaydırma analizi için Vortex yazılım paketini ve Java 64 bit'i indirin. Dışa aktarılan hücre popülasyonlarını yerel bir veritabanına yükleyin ve kümeleme parametrelerini tanımlayın. X-shift kümeleri içindeki hücre popülasyonları arasındaki uzamsal ilişkileri görselleştirmek için, kuvvet yönlendirmeli bir düzen gerçekleştirin.
CyTOF analizi, bir ila üç arasında dört popülasyon, kök hücre ve progenitör popülasyondan oluşan bir dizi tanımladı. Progenitör popülasyonlar P1 ve P2, giderek daha olgun progenitör hücrelere karşılık gelir. P3 daha önce tanımlanmıştı, ancak düşük bolluğu nedeniyle karakterize edilmedi.
Yaralanma sonrası kök ve progenitör hücre dinamikleri, eksenel nokta grafikleri ile CD9 ve CD104 kullanılarak analiz edildi. Üçüncü günde kök hücre popülasyonunda kayda değer bir artış gözlendi ve bu da genişlemeyi düşündürdü. Bu, hücre proliferasyonunu gösteren artan iyododeoksiüridin katılımı ve renk kaplaması ile gösterildiği gibi artan MyoD ekspresyonu ile desteklendi.
Yüksek seviyelerde CD98, CD44, MyoD ve iyododeoksiüridin ile işaretlenmiş aktive kök hücreler tanımlandı ve bu da yaralanma sonrası üçüncü günde yüksek proliferasyonlarının ve aktif durumlarının altını çizdi.
