Başlamak için fare derisine %70 etanol püskürtün. Daha sonra steril diseksiyon makası kullanarak cildi açın ve bacak kasını ortaya çıkarın. Kemiği net bir şekilde görmek için kasları bacakla birlikte kesin ve kemiğe zarar vermeden nazikçe çıkarın.
Kemiği hemen %4 paraldehit içeren bir tüpe yerleştirin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Tüm kemik örneklerini topladıktan sonra, tüpleri en az 24 saat boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde soğuk bir odada dört santigrat dereceye yerleştirin. Fiksasyondan sonra, kemik dokusunu orbital çalkalayıcıdan alın ve her biri üç dakika boyunca iki kez 1X PBS ile yıkayın.
Ardından, kemiğe bağlı kalan kasları çıkarmak için steril diseksiyon makası kullanın. Kemiği tekrar 1X PBS ile üç dakika yıkayın. Kemiği pH sekizde %20 DDTA içeren yeni bir kaba koyun ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 140 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
Ardından, EDTA çözeltisini taze% 20 DDTA ile değiştirin ve çalkalamayı 30 dakika daha tekrarlayın. Son EDTA işleminden sonra, taze EDTA ekleyin ve kabı gece boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin. Ardından, numuneleri EDTA kabından alın ve EDTA kalıntılarını gidermek için 1X PBS ile iki kez yıkayın.
Kemiği% 70 etanole yerleştirerek ve 140 RPM'de 15 dakika inkübe ederek dehidrasyon işlemini başlatın. Ardından, %70 etanol çözeltisini atın ve %90 etanol çözeltisi ekleyin. 140 RPM'de 15 dakika inkübe edin.
Ardından, susuz kalmış kemik dokusunu ksilen içeren yeni bir kaba yerleştirerek temizleme işlemini başlatın. 140 RPM'de 20 dakika inkübe edin. Kullanılmış ksileni taze ksilen ile değiştirin ve 20 dakika daha inkübe edin.
Ardından, temizlenmiş kemik örneğini bir gömme kasetine yerleştirin ve balmumu sızmasına başlayın. 60 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Kullanılmış balmumu atın, yeni balmumu ekleyin ve 30 dakika daha inkübe edin.
Ardından, balmumu değiştirin ve 45 dakika daha inkübe edin. Kemiği dikkatlice bir kalıba istenen yönde yerleştirin. Balmumunun soğuk bir yüzeyde katılaşmasına izin verin.
Bloğu bölümlere ayrılana kadar dört santigrat derecede saklayın. Ardından, ekipmanı bölümlere ayırmak için hazırlayın. RNazları gidermek için tüm çalışma yüzeylerine ve aletlere dekontamine edici solüsyonlar püskürtün.
Ayrıca, 42 santigrat derecede çift damıtılmış su ile bir su banyosu kurun. Yağı çıkarmak için bir mikrotom bıçağını %70 etanol ile temizleyin, ardından RNazları çıkarmak için dekontamine edin. Bıçağı mikrotom üzerine sabitleyin ve boşluk açısının 10 dereceye ayarlandığından emin olun.
Cımbız, fırça ve problara dekontamine edici solüsyonlar püskürtün ve bunları bir buz kovasında saklayın. Başka bir buz kovasına çift damıtılmış su ekleyerek bir buz banyosu hazırlayın. FFPE bloğunu mikrotom üzerine yerleştirerek kesit alma işlemine başlayın.
Mikrotomu kırpmak veya kaydırma kalınlığını 14 mikrometre olarak ayarlamak için ayarlayın. Numuneyi kesmeye başlayın ve doku görünene kadar devam edin. FFPE bloğunu bir buz banyosuna yerleştirerek nemlendirin.
Hidratlı numuneyi mikrotom numune kelepçesine sabitleyin, bıçakla hizalayın ve kaydırma kalınlığını beş mikrometreye ayarlayın. Dokuyu bölümlere ayırmaya başlayın. Kesitli dokuyu soğuk cımbız ve fırça kullanarak toplayın ve 42 derecelik bir su banyosuna yerleştirin.
Dokuyu bir cam slayt üzerine yerleştirin ve üç saat boyunca 42 santigrat derecede inkübe edin. Slaytı gece boyunca oda sıcaklığındaki bir fırında kurutun. Hazırlanan slaytı oda sıcaklığında bir slayt kutusunda saklayın.
Bu yöntem kullanılarak, aynalı femurlardan demineralize FFPE kemik örnekleri hazırlandı. Dekalsifikasyon zaman seyri, kalsifiye edilmemiş femurlar ile üç ve 24 saat boyunca dekalsifiye edilenler karşılaştırılarak optimize edildi. H ve E boyama, daha kısa dekalsifikasyon süresinin kesitlerde kırık ve hasara yol açtığını, 24 saatlik sürecin ise üstün histolojik kalite ile sonuçlandığını gösterdi.
RNA fragman dağılım değeri DV200 kullanılarak yapılan RNA kalite değerlendirmesi, kireçten arındırılmış örneklerin DV200 skorlarını %50'nin üzerinde tuttuğunu ve SCRNAC veya Uzamsal Transkriptomik gibi analizler için uygun olduğunu ortaya koydu. Bununla birlikte, uzun inkübasyon süreleri RNA bütünlüğünde bir düşüşe neden olmuştur ve bu nedenle önerilmez.
