Başlamak için, yarı steril bir ortam sağlamak için inkübatörün ve peristaltik pompanın tüm alanlarını dezenfektanla iyice temizleyin. Daha sonra her bir boruyu 700 mikrolitre magnezyum ve kalsiyum içeren PBS ile yıkayın, ardından 500 mikrolitre C2 veya EC şartlandırılmış ortam ile yıkayın. Sol boşluk için yem kilidinden peristaltik pompa durdurucusuna kısa mesafeli boruyu ve sağ boşluk için diğer simetriye sahip boruyu kullanın.
Biyoçipi inkübatörden HUVEC ve C2BBe1 hücreleri ile aldıktan sonra, her oda için 350 mikrolitre ile orta bir değişim gerçekleştirin. Ardından fişleri alttan üst bölgeye doğru hareket ettirin. Biyoçipin alt bölmesine 350 mikrolitre taze ortam ekleyin.
Bundan sonra, tüm fişleri çıkarın ve tüm bağlantı noktalarını en üste kadar doldurun. Sol boşluktan başlayarak, ilk boruyu üst bölmenin sağ portuna bağlamak için yem kilitleme adaptörünü biyoçipin portuna takın. Ardından ikinci boruyu alt bölmenin sol portuna bağlayın.
Daha sonra, bir rezervuar alın ve rezervuarın dibine küçük bir damla hücre kültürü ortamı ekleyin. Ardından rezervuarı ilk borunun karşı tarafına yerleştirin ve diğer hazne için tekrarlayın. Tüm portlar bir boruya veya rezervuara bağlandıktan sonra, rezervuarları 3,5 mililitre hücre kültürü ortamı ile doldurun.
Ardından, her bir haznenin mikroakışkan sistemini kapatmak için kapağın takılı olduğu borunun gevşek tarafını rezervuarın üstüne yerleştirin. Biyoçipi peristaltik pompaya taşıyın. Peristaltik pompa durdurucularını kullanarak, her bir boruyu peristaltik pompaya bağlayın, böylece ortam rezervuardan boşluğa ve pompa aracılığıyla geri akar.
Daha sonra her bir hazneyi dakikada 50 mikrolitrelik bir akış hızıyla perfüze edin. Ön füzyon tamamlandığında peristaltik pompayı durdurun. Her rezervuarın borusuna bağlı kapağı çıkarın ve pompanın yanındaki steril bir mendilin üzerine yerleştirin.
Tüm ortamı çıkardıktan sonra, rezervuarları 2 mililitre taze hazırlanmış ortamla doldurun. Tüpü ve kapağı yeniden bağlayın ve dairesel perfüzyona 24 saat daha dakikada 50 mikrolitre akış hızında devam edin. Peristaltik pompa durdurulduktan sonra, tüm boşlukların rezervuarlarını açın.
Rezervuarları boşaltın ve boruları ve rezervuarları biyoçipten ayırın. Mikroakışkan boşlukları oda başına iki kez magnezyum ve kalsiyum içeren 500 mikrolitre soğuk PBS ile yıkayın. Tüm boşluklara 500 mikrolitre buz gibi metanol ekleyin.
Çipi açtıktan sonra, biyoçipin yapıştırma folyosunu kesin veya çıkarın. PET membran içeren dokuyu farklı immüno-panellerle paralel olarak lekelemek için ikiye bölün. Hassas cımbız kullanarak, her bir membran parçasını, bloke edici ve geçirgen hale getiren bir çözelti ile 24 oyuklu bir plakada ayrı bir kuyuya aktarın.
Daha sonra membran parçalarını nemli bir oda içindeki temiz bir cam kızağa aktarın. Her bir membran parçasına 50 mikrolitre primer antikor hazırlanmış ve boyama solüsyonu ekleyin. Numuneler 24 oyuklu bir plakaya aktarıldıktan sonra, membranları iki kez 5 dakika boyunca yıkama solüsyonuyla, ardından magnezyum ve kalsiyum içeren PBS ile yıkayın.
Bir floresan montaj ortamı ve bir kapak camı kullanarak, membran parçalarını temiz bir cam slayt üzerine monte edin ve mikroskobik görüntülemeye kadar 4 santigrat derecede saklayın. Beş günlük bolluktan sonra, DAPI ile boyanan nükleer DNA, tüm vasküler dokuya yayılan CD68'i eksprese eden tamamen farklılaşmış monosit türevli makrofajlar gösterdi. HUVEC'ler, VE-cadherin gibi aderans bağlantılarının oluşumu ile doku bütünlüğünü gösteren birleşik bir tabaka oluşturmuştur.
Ek olarak, von Willebrand faktörü HUVEC'ler tarafından yüksek oranda ifade edilmektedir. Beş günlük bolluktan sonra, C2BBe1 hücreleri, bağlantı proteinleri E-kaderin ve ZO-1'i eksprese eden polarize epitel hücre katmanları oluşturdu. Epitelin villöz benzeri ve kript benzeri yapılarının üç boyutlu büyümesi, altı günlük perfüzyondan sonra Z yığınının x ve y bölümlerinde tespit edilebilir.
