Jel Aktivite Deneyleri için Hücre Kültürlerinden ve Küçük Hayvan Doku Örneklerinden Zenginleştirilmiş Mitokondriyal Fraksiyonların İzolasyonu

Başlamak için, paketlenmiş hücre peletini, hücre pelet hacminin yedi katına eşit bir hipotonik tampon hacminde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu bir Potter-Dounce homojenizatöre aktarın ve hücrelerin şişmesine izin vererek iki dakika buz üzerinde inkübe edin. 600 RPM'de dönen motor tahrikli bir Teflon tokmağına bağlı homojenizatörde 8 ila 10 vuruş yaparak hücre zarlarını kırın.

İzotonik bir ortam oluşturmak için hücre süspansiyonuna eşit hacimde hipertonik tampon ekleyin. Homojenatı 10 ila 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1.000G'de santrifüjleyin ve süpernatanı 1.5 mililitrelik bir polipropilen tüpe toplayın.

Mitokondriyal ham fraksiyonu toplamak için, dört santigrat derecede iki dakika boyunca 16.000G'de bir mikrofüje santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve mitokondri ile zenginleştirilmiş peleti 0,5 mililitre tampon ile yeniden askıya alın A. İki tüpün içeriğini bir araya getirin ve daha önce gösterildiği gibi santrifüjleyin. Son santrifüjlemeden sonra, peleti 300 mikrolitre tampon A'da yeniden süspanse edin. Bradford testini kullanarak mitokondriyal protein konsantrasyonunu ölçün.

Makas kullanarak 20 ila 30 miligram hayvan dokusunu kesin. Dokuyu bir süzgeç yardımıyla homojenizasyon tamponunda üç ila dört kez yıkayın, daha küçük parçaları kaybetmemeye dikkat edin. Doku parçalarını tampon ile homojenizatöre aktarın.

Karaciğer, dalak ve böbrek dokuları için, LVM Potter'da 600 RPM'de motorlu bir Teflon havaneli ile dört ila altı yukarı ve aşağı vuruş gerçekleştirin.