Hidrojen peroksit ile indüklenen MCF-7 hücre kültürü oluşturduktan sonra, süpernatanı kültür kabından atın. Bir mililitre PBS ekleyin ve PBS'yi atmadan önce tabağı hafifçe sallayın. Şimdi hücreleri yıkamak için bir mililitre tripsin ekleyin, tabağı sallayın ve bir dakika bekleyin, ardından tripsin atın.
Tabağa hafifçe vurun, ayrılmayı onaylamak için tabakadaki hücre hareketini gözlemleyin. Daha sonra, dört mililitre tam kültür ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Süspansiyonu 800G'de beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
Peletleri yeniden süspanse etmek için 200 mikrolitre PBS ekleyin ve hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bundan sonra, hücreleri bozmak için tekrarlanan donma-çözülme döngüleri gerçekleştirin. Hücre lizatını 1500G'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı analiz için toplayın.
Tahlillere başlamadan önce ELISA reaktiflerini oda sıcaklığında 20 dakika çözdürün, kullanmadan 15 dakika önce ELISA okuyucuyu önceden ısıtın. Gerekli 20 kez konsantre yıkama tamponunu deiyonize su ile seyrelterek çalışan bir çözeltiye seyreltin. Standart numunelerin çalışma solüsyonlarını hazırlayın ve kabarcık oluşmadan dikkatlice yukarı ve aşağı karıştırın.
Boş kuyular hariç olmak üzere reaksiyon kuyularına 50 mikrolitre standart çalışma çözeltisi ve farklı konsantrasyonlarda tespit numuneleri ekleyin, her reaksiyon kuyucuğuna 100 mikrolitre yaban turpu peroksidaz konjuge tespit antikoru ekleyin. Kuyuları bir plaka contası ile kapatın ve 37 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, antikor çözeltisini çıkarın.
Kuyucuklarda kalan sıvıyı silkeleyin ve emici kağıt üzerinde kurulayın. Her reaksiyon kuyucuğuna 350 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. Bir ila iki dakika sonra, her reaksiyona 50 mikrolitre substrat A ve B eklemeden önce tamponu atın.
Plakayı kapatın ve karanlıkta 37 santigrat derecede inkübe edin. 15 dakika sonra, her reaksiyon kuyucuğuna 50 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin. Bir ELISA okuyucu ile 450 nanometre dalga boyunda optik yoğunluk değerini hemen ölçün.
Hidrojen peroksitin MCF-7 hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkisi, 12 saat boyunca 0.75 milimolar ile tedavinin canlılığı %67'ye düşürdüğünü gösterdi.1.5 milimolar daha yüksek bir konsantrasyonda, hücre canlılığı büyük ölçüde %3'ün altına düştü MCF-7 hücreleri, artan hidrojen peroksit muamelesi konsantrasyonunun ardından, oksidatif stresin DNA hasarı üzerindeki etkisini gösteren 8-Okso-dG seviyelerinin arttığını gösterdi.
